Эукариотическая ДНК-топоизомераза II типа
На протяжении долгого времени в литературе идет дискуссия о том, зачем эукариотические ДНК-топоизомеразы II используют энергию ATP, осуществляя термодинамически выгодную реакцию релаксации. Было показано [ 40 ], что топоизомеразы II способны сдвигать термодинамическое равновесие в реакции релаксации или декатенации ДНК, создавая более узкое распределение топоизомеров, чем например, топоизомераза I . Предполагалось, что этот процесс физиологически значим, например, для полного разделения дочерних хроматид после репликации, и для него необходима энергия ATP. Способность осуществлять такой неравновесный процесс предположительно связана со способностью топоизомераз сильно изгибать ДНК при связывании и предпочтительно связывать Т-сегмент с определенной геометрией [ 41 , 10 ].
Однако было подсчитано, что необходимая для этого энергия чрезвычайно мала: энергия релаксированной ДНК в присутствии топоизомеразы II и ATP отличается от равновесной меньше чем на kT [ 42 ]. Физиологическая значимость неравновесного упрощения топологии тоже находится под вопросом [ 39 ], в частности, полное разделение дочерних хроматид, как сейчас известно [ 43 ], достигается за счет положительной сверхспирализации вносимой конденсинами . Максвелл и Бейтс [ 39 ] предположили, что энергия ATP необходима для сохранения прочных контактов между субъединицами фермента в комплексе с разорванной ДНК. Действительно, хотя ДНК-топоизомеразы IIA могут расщеплять ДНК и в отсутствии ATP, связывание ATP значительно стимулирует реакцию. Согласно анализу кристаллической структуры топоизомеразы II дрожжей Saccharomyces cerevisiae [ 44 ], объяснение смещению равновесия в присутствии ATP состоит в следующем: при связывании ДНК происходят конформационные изменения фермента, приводящие к тому, что тирозины активных сайтов оказываются вблизи фосфодиэфирных связей, однако на расстоянии недостаточном для нуклеофильной атаки.
Происходящая при связывании ATP димеризация N-концевого домена приводит к структурным изменениям, перемещающим тирозины в позицию, необходимую для катализа. С-концевые ворота фермента в комплексе с разорванной ДНК закрыты, в противоположность положению тех же ворот в комплексе с цельной ДНК. Изменение положения каталитического тирозина Y782 при расщеплении ДНК передается к С-воротам, находящимся на расстоянии 50Е от активного сайта фермента через сеть солевых мостиков. Таким образом, ATP-зависимое закрытие N-концевых и С-концевых ворот фермента при расщеплении ДНК представляет собой защитный механизм, предотвращающий диссоциацию двух субъединиц фермента в то время как ДНК находится в разорванном состоянии.
Этот механизм обеспечивает защиту клетки от опасности возникновения двухцепочечных разрывов ДНК и незаконной рекомбинации [ 39 ]. Для катализа ДНК-топоизомеразе II также необходимы ионы Mg2+. Анализ кристаллической структуры показал, что в активном сайте фермента находятся два иона металла: один принимает непосредственное участие в нуклеофильной атаке, стабилизируя уходящую группу, а другой фиксирует ДНК [ 29 , 44 ]. По-видимому, механизм расщепления ДНК с участием ионов Mg2+ - общий для топоизомераз IA и IIA [ 28 , 29 ]. У E. coli есть два фермента, относящихся к IIA типу - ДНК-гираза и топоизомераза IV . ДНК-гираза использует энергию гидролиза ATP для введения отрицательных сверхвитков в молекулу ДНК, а также способна к релаксации положительных и отрицательных сверхвитков (для этих процессов ATP не нужен [ 41 ].
