Продукты электрофильного присоединения к ДНК
Многие электрофильные агенты эффективно реагируют с нуклеофильными центрами в ДНК [ Singer, ea 1982 ]. К ним, в частности, относится большинство химических канцерогенов , ряд которых ( этилнитрозомочевина и метилнитрозомочевина (MNU) , N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин , метилметансульфонат ) широко используются как мутагены в лабораторной практике; некоторые электрофильные реагенты, наоборот, применяются в качестве противоопухолевых средств [ Lawley, ea 1996 ]. При атаке ДНК электрофильное присоединение в принципе может идти по любой экзоциклической кето- или аминогруппе азотистых оснований, по любому гетероциклическому атому азота, за исключением N9 пуриновых и N1 пиримидиновых оснований, и по свободным атомам кислорода фосфодиэфирных связей, однако чаще всего алкилированию подвергаются позиции N3 Ade и N7 Gua [ Singer, ea 1982 ].
Некоторые алкилирующие агенты (например, иприты ) содержат два электрофильных центра и могут таким образом вызывать сшивку двух звеньев ДНК в одной или в разных цепях, другие модифицируют только одно звено. В результате атаки азотистых оснований бифункциональными электрофилами эпоксидной или альдегидной природы с последующим дегидрированием и закрытием кольца возникают этенопроизводные оснований ДНК: 1,N6- этеноаденин (e-Ade), N2,3-этеногуанин, 1,N2-этеногуанин и 3,N4- этеноцитозин (e-Cyt) [ Gros, ea 2003 ].
Как и в случае окислительного повреждения, источники генотоксичных электрофильных агентов можно разделить на экзо- и эндогенные. Разнообразие экзогенных электрофильных агентов весьма высоко; большинство из них представляет собой продукты метаболизма органических молекул системой цитохромов P450 [ Friedberg, ea 2006 ].
Например, табачный дым содержит большое количество N-нитрозаминов и полициклических ароматических углеводородов, которые, активируясь системой цитохромов P450, повреждают ДНК и приводят к развитию рака органов дыхательной системы. Главным эндогенным генотоксичным электрофильным агентом служит нормальный клеточный метаболит S-аденозилметионин ; по некоторым оценкам, только за его счет в клетках млекопитающих образуется ~6000 оснований 7-mGua и ~1200 3-mAde на клеточное деление [ Rydberg, ea 1982 ]. Перекисное окисление липидов также дает электрофильные продукты, которые приводят, в частности, к образованию этенопроизводных азотистых оснований [ Marnett, ea 2000 ].
Значительная часть продуктов электрофильного присоединения подвергается репарации по путям, отличным от ЭРО . Так, продукты присоединения сравнительно больших заместителей (ароматических аминов, активированных производных полициклических ароматических углеводородов и т.п.) и внутрицепочечные сшивки репарируются в основном по пути эксцизионной репарации нуклеотидов , межцепочечные сшивки, вызванные бифункциональными алкилирующими агентами (цисплатин, иприты, псоралены) - по пути рекомбинационной репарации , а основания O6-алкилгуанин, O4- алкилтимин, N1-алкиладенин и N3-алкилцитозин - при помощи реактивации алкилтрансферазами или диоксигеназами [ Friedberg, ea 2006 ]. ЭРО, в свою очередь, играет главную роль в репарации N3- и N7- алкилпуринов и этенопроизводных азотистых оснований.
Несмотря на то, что N3- и N7-алкилпурины как поврежденные основания в ДНК известны уже несколько десятков лет [ Lawley, ea 1963 ], их действие на ДНК-зависимые ферменты и процессы охарактеризовано плохо. Причина этого заключается в нестабильности образуемых ими N-гликозидных связей и отсутствия вследствие этого возможностей селективного введения этих оснований в ДНК. Изучение экспериментальных моделей организмов, дефицитных по репарации N3- и N7-алкилпуринов, позволяет предположить, что их присутствие в ДНК дает классическую картину блокирования репликации: в клетках млекопитающих это арест клеточного цикла на границе G1/S , индукция белка p53 , апоптоз и гибель клеток [ Engelward, ea 1997 ]. Известные структуры ДНК-полимераз в комплексе с ДНК объясняют, каким образом метилирование положения N3 пуринового гетероцикла в матричной цепи может приводить к блокированию фермента: атом N3 образует водородную связь с остатком Arg, высококонсервативным в ДНК-полимеразах [134]. В последние годы был разработан метод селективного алкилирования ДНК при помощи активированных малобороздочных пептидных лигандов, дающий 3-mAde в определенных последовательностях ДНК с выходом >90% относительно других продуктов [ Fronza, ea 2004 ]. Это позволяет надеяться, что последствия возникновения 3-mAde в ДНК будут выявлены более четко.
В отличие от пуринов, алкилированных в кольцо, существуют надежные методы синтетического введения этенопроизводных в ДНК, и свойства этих продуктов электрофильного присоединения изучены гораздо лучше. Например, присутствие в ДНК оснований e-Cyt ведет к заменам C-A и C-T, а e-Ade - к заменам A-G и A-T с частотой, достигающей >80% в клетках млекопитающих [ Basu, ea 1993 ], что в целом согласуется со специфичностью включения различных dNMP напротив этих звеньев ДНК-полимеразами.
Особняком среди поврежденных пуриновых оснований стоит 2,4- диамино-6-оксо-1,6-дигидропиримидин-5-ил(метил)формамид (mFapy-Gua). Это формамидопиримидиновое производное образуется при гидролизе 7- метилгуанина и поэтому не относится к продуктам окислительного повреждения [ Lawley, ea 1963 ].
mFapy-Gua существует в виде двух взаимопревращающихся ротамерных форм, способных образовывать разные наборы водородных связей [ Boiteux, ea 1984 ]. Поскольку пути репарации mFapy-Gua близки к таковым неметилированных Fapy-оснований, все эти поврежденные основания часто рассматривают вместе, однако сравнение биологических последствий возникновения Fapy-Gua и mFapy-Gua, ставшее возможным после разработки методов введения Fapy-Gua в ОДН, показывает, что такое объединение неправомерно. mFapy-Gua в ДНК-матрице блокирует синтез ДНК-полимеразами гораздо сильнее, чем неметилированное основание Fapy-Gua (за счет неэффективного включения следующего по ходу синтеза dNMP) [ Boiteux, ea 1983 ]. Однако остаточный синтез протекает преимущественно с немутагенным включением dCMP [ Asagoshi, ea 2002 ]. Таким образом, в отличие от Fapy-Gua, mFapy-Gua - это цитотоксическая, но слабомутагенная модификация.
