ДНК-гликозилазы пиримидиновых димеров из Micrococcus luteus Mlu-Pdg1 и Mlu-Pdg2
Ферментативная активность, специфически расщепляющая ДНК по ЦПД , была обнаружена в экстрактах актинобактерии M.luteus еще до того, как ДНК- гликозилазы были описаны как отдельный класс ферментов [ Strauss, ea 1966 ]. Достаточно долго она считалась эндонуклеолитической, и лишь в 1980-хгг. было показано, что фермент представляет собой ДНК-гликозилазу с ассоциированной AP-лиазной активностью [ Bailly, ea 1989 , Haseltine, ea 1980 ].
В большей части работ, выполненных с ДНК-гликозилазой пиримидиновых димеров M.luteus, белок описан как имеющий молекулярную массу ~17кДа.
Ген M.luteus, кодирующий белок с соответствующей активностью (154 а.к.о., расчетная ММ 17140Да), был клонирован, и было показано, что он способен восстанавливать устойчивость к УФ в штаммах E.coli uvrA [ Shiota, ea 1997 ].
Сообщалось о том, что последовательность полипептида гомологична эндонуклеазе V фага T4 [ Shiota ea 1997 ], но низкий уровень гомологии (~27%) и большое количество длинных брешей при выравнивании не позволяют с определенностью отнести эти белки к одному структурному классу. Однако оказалось, что в M.luteus присутствует еще один фермент с точно такой же активностью, субстратной специфичностью и каталитическим механизмом, но гомологичный не первой ЦПД-ДНК-гликозилазе, а эндонуклеазе III [ Piersen, ea 1995 ]. Этот белок представляет собой полипептид длиной 211а.к.о. с расчетной ММ 30471Да, в котором сохраняются все основные мотивы центральных семейств суперсемейства Nth, в том числе остатки Cys, координирующие FeS-кластер. Первая и вторая ДНК-гликозилазы пиримидиновых димеров далее обозначаются Mlu-Pdg1 и Mlu-Pdg2 соответственно.
В отличие от большинства других ДНК-гликозилаз суперсемейства Nth, которые распространены практически во всех организмах, последовательности, гомологичные Mlu-Pdg1 и Mlu-Pdg2 встречаются очень спорадично. Гомологи Mlu-Pdg1 отсутствуют в других актинобактериях, но их можно обнаружить в отдельных родах Proteobacteria и Thermotogales . Распределение гомологов Mlu-Pdg2 также ограничено очень немногими не родственными друг другу видами. Интересно, что из Neisseria mucosa также были выделены две ЦПД-ДНК-гликозилазы, по размерам и свойствам сходные с Mlu-Pdg1 и Mlu-Pdg2, но клонированы они не были, и их последовательности неизвестны, хотя определенная секвенированием по Эдману N-концевая последовательность одной из них обнаруживает гомологию с Nth [ Nyaga, ea 2000 ].
Как и все ДНК-гликозилазы, оба фермента Mlu-Pdg расщепляют N- гликозидную связь поврежденного дезоксинуклеотида. В случае ЦПД модификации подвергаются два соседних звена ДНК, и расщепление происходит только в том из них, которое находится с 5'-стороны [ Haseltine, ea 1980 ].
Таким образом, продукт реакции, катализируемой ЦПД-ДНК-гликозилазами, принципиально отличается от продуктов действия других ДНК-гликозилаз тем, что поврежденный элемент не выщепляется из ДНК, а остается ковалентно связанным с ней N-гликозидной связью 3'-концевого дезоксинуклеотида в составе ЦПД. Поэтому для полной репарации в этом случае необходима деградация участка ДНК с 3'-стороны от разрыва, внесенного Mlu-Pdg.
Предпочтительным субстратом для Mlu-Pdg1 служат димеры T^T, которые расщепляются примерно на порядок лучше, чем ЦПД другого состава [ Gordon, ea 1980 ]; действие фермента на разные изомеры пиримидиновых димеров не изучалась. Mlu-Pdg2 расщепляет ДНК по цис-син-ЦПД T^T, но не обладает активностью в отношении транс-син-изомеров, [6-4]-фотопродуктов и изомеров Дьюара [ Piersen, ea 1995 ]. Гомолог Pdg2 из N.mucosa обладает гораздо более широкой специфичностью; в число его субстратов входят цис-син-ЦПД, транс-син-I-ЦПД, [6-4]- фотопродукты, изомеры Дьюара и H2Ura [ Nyaga, ea 2000 ].
Участие Mlu-Pdg в репарации ЦПД in vivo подтверждается тем, что природный штамм M.luteus DB7, дефицитный одновременно по ЦПД-ДНК- гликозилазной активности и гену uvrA системы эксцизионной репарации нуклеотидов, гораздо более чувствителен к УФ, чем штаммы, дефицитные только по ЦПД-ДНК-гликозилазам [ Nakayama, ea 1992 ].
