Окисленные пиримидиновые основания
Окисление пиримидиновых оснований ДНК приводит к образованию нескольких главных и многих минорных продуктов, причем спектр продуктов достаточно сильно различается в зависимости от окислительно- восстановительного потенциала раствора [ von Sonntag 2006 ]. К наиболее распространенным окисленным пиримидиновым основаниям относятся продукты окисления тимина - тимингликоль (Thy(OH)2), 5,6- дигидротимин (H2Thy), 5-гидроксиметилурацил (hmUra), 5-формилурацил (fUra), 5-гидрокси-5,6-дигидротимин и 5-гидрокси-5-метилгидантоин, и продукты окисления цитозина - цитозингликоль, 5,6-дигидроурацил (H2Ura), 5-гидроксицитозин (5-OH-Cyt), 5-гидроксиурацил (5-OH-Ura), 5-гидрокси- 5,6-дигидроцитозин, 5,6-дигидроксицитозин и 5-гидроксигидантоин. Как и в случае окисленных пуринов, лучше всего изучены свойства тех из них, для которых разработаны методы постсинтетического или синтетического введения в ДНК.
Данные по структурным и таутомерным свойствам окисленных пиримидиновых оснований в двуцепочечной ДНК достаточно немногочисленны. Присутствие непланарного Thy(OH)2 вызывает значительные локальные изменения конформации ДНК и сопровождается частичным выведением поврежденного основания из внутренней части спирали в большую бороздку [ Kung, ea 1997 ]. Планарные окисленные пиримидины вызывают гораздо меньшее искажение канонической структуры B-ДНК. hmUra образует канонические уотсон- криковские связи с Ade и связи типа "качания" с Gua [ Mellac, ea 1993 ]. pKa атома N3 основания hmUra снижено по сравнению с Thy, что приводит к наличию минорного C4-енольного таутомера, образующего связи уотсон-криковского типа с Gua [ Mellac, ea 1993 ]. C5-гидроксильная группа hmUra служит донором водородной связи и может образовывать ее с атомом N7 пуриновых оснований, соседних с поврежденным звеном, искажая таким образом картину водородных связей в большой бороздке и потенциально влияя на узнавание последовательностей ДНК белками [ Mellac, ea 1993 ]. Основание fUra также образует каноническую уотсон- криковскую пару с Ade и привносит в большую бороздку акцептор водородной связи [ Tsunoda, ea 2001 ]; таутомеризация fUra и возможность образования пар с другими основаниями не исследована. 5-OH-Ura способен образовывать достаточно устойчивые пары со всеми каноническими азотистыми основаниями ДНК, очевидно, за счет облегчения таутомеризации [ Thiviyanathan, ea 2005 ].
Остатки Thy(OH)2 большей частью блокируют синтез ДНК репликативными и репаративными ДНК-полимеразами [ Evans, ea 1993 ]. Данные РСА свидетельствуют о том, что блокирование ДНК-полимераз связано с нарушением конформации ДНК в активном центре за счет непланарного расположения заместителей при связи C5-C6 основания Thy(OH)2 [ Aller, ea 2007 ]. Праймер-матричный дуплекс с dAMP, включенным напротив Thd(OH)2, служит субстратом для корректирующей 3'-5' экзонуклеазной активности ДНК- полимераз [ Evans, ea 1993 ]. Транслезионные ДНК-полимеразы ведут эффективый синтез при наличии Thy(OH)2 с корректным включением dAMP [ Johnson, ea 2003 ] либо с потенциально мутагенным включением любого из канонических dNMP [ Kusumoto, ea 2002 ]. Эффективность включения в ДНК dTMP(OH)2 из соответствующего окисленного dNTP весьма низка [ Ide, ea 1987 ]. Блокирование транскрипции Thy(OH)2 варьирует от 0 до 50% в зависимости от РНК-полимеразы и присутствия дополнительных факторов транскрипции [ Kuraoka, ea 2007 , Kathe, ea 2004 ]. При нахождении в ДНК-матрице оснований 5-OH-Ura и 5-OH-Cyt ДНК- полимеразы умеренно блокируются ими, однако происходит и достаточно эффективное включение dNMP, специфичность которого сильно зависит от окружающей последовательности [ Purmal, ea 1994 , Vaisman, ea 2001 ]. Напротив 5-OH-Ura могут включаться dAMP и dCMP, а напротив 5-OH-Cyt - dGMP, dAMP и dCMP. Транслезионная ДНК-полимераза иота способна включать напротив этих поврежденных звеньев любой из канонических dNMP, но в случае 5-OH-Ura синтез преимущественно продолжается в случае включения dGMP, что может служить для снижения мутагенности этого поврежденного основания [ Vaisman, ea 2001 ]. 5-OH-dUTP и 5-OH-dCTP могут использоваться ДНК- полимеразами в качестве субстратов, причем если первый включается лишь напротив Ade в ДНК-матрице, то второй может включаться как напротив Gua, так и напротив Ade [ Purmal, ea 1994 ]. На синтез РНК РНК-полимеразами наличие 5-OH-Ura и 5-OH-Cyt в матрице влияния не оказывает [ Kathe, ea 2004 ], но специфичность включения NMP не изучена. 5-OH-Cyt, в зависимости от положения в участке узнавания, оказывает влияние на эффективность расщепления топоизомеразой I [ Pourquier, ea 1999 ].
ДНК-матрицы, содержащие H2Thy и H2Ura служат достаточно эффективными субстратами ДНК-полимераз и направляют включение dAMP, которое в первом случае немутагенно, а во втором потенциально ведет к транзиции C-T [ Ide, ea 1991 , Kumar, ea 2007 ]. Так же, как и в случае 5-OH-Ura, при наличии H2Ura в матрице возможен преимущественно немутагенный синтез транслезионной ДНК-полимеразой иота за счет преимущественного продолжения синтеза после включения dGMP [ Vaisman, ea 2001 ]. H2TTP эффективно включается напротив Ade в ДНК-матрице ДНК-полимеразой I и фрагментом Кленова [ Ide, ea 1987 , Ide, ea 1988 ], но не включается ДНК-полимеразой фага T4 и обратной транскриптазой AMV [ Ide, ea 1988 ]; свойства H2dUTP как субстрата ДНК-полимераз не изучены. РНК-полимеразы преимущественно включают AMP напротив H2Ura в ДНК-матрице, что может вызывать транскрипционный мутагенез [ Viswanathan, ea 1999 ]. H2Ura входит в состав тРНК, и РНК-полимеразы используют H2UTP в качестве субстрата [ Roy-Burman, ea 1965 ], однако его включение в мРНК не должно вести к изменению кодирующих свойств.
Основания hmUra и fUra в ДНК-матрице не блокируют действие ДНК- и РНК-полимераз, и hmUra может даже заменять Thy в геноме некоторых бактериофагов [ Zhang, ea 1997 , Zhang, ea 1999 ], однако напротив fUra с низкой эффективностью может включаться не только dAMP, но и dGMP [ Masaoka, ea 2001 ]. hmdUTP также достаточно эффективно используется ДНК-полимеразами и не вызывает мутаций [ Levy, ea 1991 ], в то время как fdUTP в основном немутагенен, но может в зависимости от окружающей последовательности с небольшой эффективностью включаться напротив Gua в ДНК-матрице [ Terato, ea 1999 ]. Мутагенность hmUra в клетках млекопитающих очень низка [ Boorstein, ea 1988 ], однако его присутствие ведет к индукции сестринских хроматидных обменов, что свидетельствует о нарушении механизмов поддержки стабильности генома. Модификация ДНК остатками fUra предотвращает ее расщепление рестриктазами, в то время как hmUra не оказывает такого действия [ Zhang, ea 1999 ]. Также fUra может нарушать нормальную терминацию транскрипции [ Guerniou, ea 2005 ].
