PS-гены: участие в протеолитическом расщеплении Notch
Участие PS-генов (пресенилинов) в регуляции Notch сигнального пути было впервые показано на нематодах ( Caenorhabditis elegans ). Один из генов-гомологов пресенилинов у C. elegans - ген sel-12 был впервые обнаружен при скрининге генов-супрессоров гиперактивного аллеля lin-12 - гомолога Notch, проявляющегося в фенотипе развития множества вульв. Мутации в sel-12 приводили к нарушению откладки яиц за счет недоразвития вульвы, фенотипу, характерному для мутантов с гипоморфным аллелем lin-12 ( Levitan, 1995 ). При инактивации двух гомологов пресенилинов у C. elegans ( гена sel-12 и гена hop-1 ) наблюдали гибель эмбрионов, недоразвитие передней части глотки и экскреторной системы и другие фенотипы, встречающиеся при инактивации двух Notch генов ( гена lin-12 и гена glp-1 ) ( Li, 1997 ; табл. 1 , табл. 3 ).
На модели C. elegans было также показано, что мутантный sel-12 не изменял фенотипа "мультивульв" при повышенной активности Notch гена, получаемой за счет экспрессии внутриклеточного домена NICD ( Levitan, 1998 ). Levitan и Greenwald предположили, что SEL-12/пресенилины могут участвовать в расщеплении LIN-12/Notch.
Гомолог пресенилина у плодовой мушки ( Drosophila melanogaster ) был клонирован в 1997 году ( Boulianne, 1997 ). Мутантные линии D. melanogaster с делециями в гене PS имели такие же фенотипические дефекты, как и линии с инактивацией Notch (нейральная гиперплазия, нарушение сегрегации нейробластов, специфические нарушения при дифференцировке имагинальных дисков, гибель на стадии сформировавшейся личинки первого возраста с недоразвитием дорсальной и вентральной кутикулы и др.) ( Struhl, 1999 ; Ye, 1999 ). На модели трансгенных D. melanogaster было также показано, что Notch белок (полноразмерный, а также дельтаNotch) с транскрипционным фактором Gal4-VP16 (GV), искусственно введенным сразу после трансмембранного домена Notch, подвергался внутримембранному расщеплению. GV-NICD попадал в ядро и активировал репортерную конструкцию UAS-lacZ, регулируемую фактором GV. Такой сигнальный путь был возможен только при нормальной функции PS гена.
Экспрессия GV-NICD, приводящая к конститутивной активации UAS- lacZ, не зависела от наличия PS ( Struhl, 1999 ). Показано также, что экспрессия NICD, но не дельтаNotch, могла приводить к спасению фенотипических нарушений при инактивации PS ( Struhl, 2001 ). Из полученных данных следовало, что, как и у C. elegans, действие PS D. melanogaster предшествует ядерной активации генов, и, по всей видимости, PS отвечает за высвобождение NICD в цитоплазму, способствуя расщеплению Notch внутри мембраны.
При изучении фенотипа мышей, нокаутированных по гену PS1, было обнаружено, что такие мыши умирали вскоре после рождения и имели нарушения развития скелета и структур мозга ( Shen, 1997 ). Нокауты по PS2 были жизнеспособны и фертильны. При анализе фенотипа этих мышей были найдены лишь не сильно выраженные сосудистые изменения в легочной паренхиме ( Herreman, 1999 ). Мыши с двойными нокаутами по пресенилинам (PS1-/-, PS2-/-) умирали на 9,5-й день внутриутробного развития со множественными дефектами эмбриональной дифференцировки, которые связывали с глобальным нарушением паттернинга мезодермы ( Donoviel, 1999 ; Herreman, 1999 ). Похожий фенотип у мышей наблюдали при инактивации гена Notch1 ( Swiatek, 1994 ; Conlon, 1995 ).
Показано, что в гомогенатах мозга эмбрионов мыши PS1-/-, количество зрелого белка Notch (процессированного в сайте S1), по сравнению c мышами дикого типа, не изменялось. При трансфекции нейрональных клеточных культур и фибробластов мышей PS1-/- или PS1+/+ конструкцией, содержащей дельтаNotch, было показано, что продукция NICD ингибировалась в клетках PS1-/- ( De Strooper, 1999 ). В аналогичных экспериментах на бластоцистах с двойными нокаутами по PS1-/-, PS2-/- продукция NICD не детектировалась совсем ( Zhang, 2000 ). Протеасомные ингибиторы MG132, MDL 28170, а также гамма-секретазный ингибитор на основе конфигурации субстрата - дифлюро-кетонный пептидомиметик MW167, снижали продукцию NICD. При экзогенной экспрессии NICD в нейрональных культурах, внутриклеточный домен транспортировался в ядро вне зависимости от генотипа PS1-/- или PS1+/+ ( De Strooper, 1999 ).
Таким образом, данные об участии пресенилинов в протеолизе Notch и регуляции Notch-зависимой сигнальной трансдукции, согласовывались в различных моделях in vitro и in vivo, как у беспозвоночных, так и у позвоночных животных. Более того, в экспериментах по коиммунопреципитации на клетках человека и D. melanogaster, было показано физическое связывание пресенилинов с Notch субстратом ( Ray, 1999 ).
Как и для APP , мутации в консервативных аспартатах PS1, PS2 и С- концевом пролине ингибировали S3-протеолиз Notch (PS1-/-) ( Wolfe, 1999a ; Steiner, 1999 ; Tomita, 2001 ; Wang, 2004 ). До последнего времени продолжались споры о том, является ли пресенилин гамма-секретазой сам по себе или же кофактором гамма-секретазной активности. Результаты экспериментов по введению мутаций в инвариантные аспартаты PS1 и действию дифлюро-кетонных ингибиторов, известных ингибиторов аспартатных протеаз, поддерживают точку зрения о том, что пресенилины представляют новое семейство необычных аспартатных протеаз, осуществляющих внутримембранное расщепление клеточных рецепторов типа 1 ( Wolfe, 1999b ).
