Фенотипическая модификация трансплантируемых клеток
Фенотипическая модификация трансплантируемых клеток проводилась с помощью мРНК для молекул (антигенов) гистосовместимости .
Экспериментально установленные факты (см. предыдущие главы этого раздела " Аллогенная ингибиция: анализ механизмов ингибиции ") позволяют сделать основное заключение о том, что аллогенное подавление проявляется всегда, когда между донорскими клетками и хозяином имеются генетические различия.
Восстановление генетической идентичности, в частности, путем создания адекватного клеточного микроокружения, приводит к нормальному развитию трансплантируемых клеток или тканей. Особое значение в явлении аллогенной ингибиции принадлежит антигенам гистосовместимости.
В работах по отмене аллогенного подавления колониеобразующей способности клеток костного мозга проводилось искусственное воздействие на организм реципиента - создание генетически адекватного трансплантируемым клеткам микроокружения.
Возможен иной путь - путь специфического воздействия на клетки донора. Инкубация клеток (первого родителя) с РНК от аллогенного донора (второго родителя) или от гибридного реципиента определит формирование на поверхности культивируемых клеток антигенных структур, свойственных донору РНК. Подобная антигенная модификация аллогенных клеток, по предположению, должна отменить фенотипические различия между донором клеток и реципиентом и довести результат межклеточных взаимодействии при колониебразовании до уровня, свойственного сингенным системам.
Для решения основной задачи исследования использовались различные классы РНК, выделенные методом фенольно-термического фракционирования с использованием диэтилпирокарбоната - неспецифического ингибитора нуклеаз. Были изучены следующие классы РНК:
- класс цитиплазматических РНК (температурная фракция 0-40 по С),
- класс пре-рРНК и рРНК (температурная фракция 400 по С),
- класс РНК, содержащий смесь пре-рРНК и пре-мРНК (температурная фракция 550 по С),
- класс ДНК-подобной пре-мРНК (температурная фракция 630 по С) и
- класс трудноэкстрагируемых пре-мРНК ядра (температурная фракция 850 по С).
Каждая фракция охарактеризована по содержанию остаточного белка, нуклеотидному составу и полимерным свойствам при анализе препаратов по электрофоретической подвижности в полиакриламидном геле и по коэффициенту седиментации в градиенте плотности сахарозы. В работе использовались только те фракции, которые имели высокополимерный молекулярный состав и были лишены спектрофотометрически выявляемого белка.
Во всех случаях независимо от конкретных задач исследования проводилась инкубация анализируемых клеток с одним из классов РНК в течение 30 мин при 370 по С. Проинкубированные клетки вводили сингенным или аллогенным реципиентам.
В табл. 11.2 представлены данные по числу КОЕ в селезенке мышей F1, которым вводили либо интактные клетки костного мозга, либо клетки, обработанные тотальной РНК, выделенной из селезенки родителей или их гибридов. Видно, что число КОЕ снижено, если F1 реципиентам трансплантировали клетки костного мозга от родителей линии СВА. Колониеобразование не подавлялось, когда использовали клетки костного мозга от мышей линии DBA/2. Результаты этой части опытов служат основой для анализа влияния РНК на колониеобразующую способность клеток костного мозга линии мышей, подвергающихся аллогенной ингибиции.
Предварительная инкубация клеток костного мозга мышей линии СВА с "сингенной" РНК (РНК из селезенки линии СВА) не приводит к восстановлению колониеобразования. При инкубации клеток костного мозга мышей той же линии с РНК из селезенки второго родителя (линии DBA/2) или гибрида F1 наблюдается восстановление числа КОЕ.
В то же время РНК, выделенная из селезенки линии мышей, отличающейся по Н-2 -комплексу от родительских линий (CC57W - H-2b ), оказывается инертной в эффекте отмены аллогенной ингибиции.
Представленные факты говорят в пользу линейной специфичности действия РНК.
При работе с другим гибридом - (СВА*C57BL/6J)F1 - получены аналогичные резултьтаты.
Работа с тотальным препаратом РНК дает представление о принципиальной возможности отмены аллогенной ингибиции с помощью РНК "линейной специфичности", но затрудняет трактовку полученных данных.
Cледующая серия экспериментов проведена с различными классами РНК. Данные, представленные на рис. 11.3 , демонстрируют, что наибольшей активностью в отмене аллогенной ингибиции обладает класс пре-мРНК ядра (фракция 630 по С), полученной от реципиента.
Дополнительное подтверждение специфичности наблюдаемой отмены аллогенной ингибиции получено из сравнительных опытов с пре-мРНК, выделенной от линии донора (С57BL) и от линии реципиента (СВА*С57BL)F1 ( рис. 11.4 ).
Видно, что инкубация клеток костного мозга мышей линии С567BL/6J с различными классами РНК, выделенными из селезенки мышей той же линии, не обеспечивает какого-либо восстановления аллогенного подавления. Ни один из классов РНК донорского типа не способен определить нормализацию колониеобразования в гибридном организме. Восстанавливающий эффект различных классов РНК реципиента (F1) аналогичен тому, который представлен на рис. 11.3 .
В феномене отмены аллогенного барьера, возможно, имеет место общий механизм, определяемый матричной активностью РНК определенного генотипа. Вероятно, "линейная специфичность" действия экзогенной РНК связана с модификацией клеточной поверхности через появление структур ( Н-2 антигенов) того генотипа, который послужил источником РНК.
В пользу подобного предположения говорят и те эксперименты, которые выявили наибольшую активность класса пре-мРНК ядра в фенотипической модификации клеточных отношений.
Для подтверждения высказанной точки зрения были поставлены опыты in vitro с целью прямого наблюдения за возникновением специфических антигенов, соответствующих донору РНК. Работа проводилась с клетками перитонеального экссудата мышей линий СВА и С57BL/6J, различными классами РНК мышей этих же линий и антисыворотками: СВА анти-С57BL/6J и C57BL/6J анти-СВА.
Внесение в монослойную культуру макрофагов пре-мРНК аллогенного донора приводит к появлению через 48 часов культивирования антигенов донора РНК, что оценивается с помощью соответствующей цитотоксической антисыворотки ( рис. 11.5 ).
Возникновение аллоантигенов донора РНК связано с высокополимерной пре-мРНК, т.к. использование препарата, выделенного в отсутствии диэтилпирокарбоната и характеризующегося преимущественным содержанием низкомолекулярных фрагментов, не обеспечивает серологической модификации культивируемых клеток.
Экспрессия антигенов донора РНК характеризуется определенной динамикой. Пик выхода антигенов наблюдается через 48 часов после внесения РНК в культуру ( рис. 11.6 ).
Наибольшей антигенсинтезирующей активностью обладает класс пре-мРНК, определенная активность наблюдается и у суммарной фракции цитоплазматической РНК. Класс рибосомальной РНК не проявляет какую-либо активность ( рис. 11.7 ).
Основные антигены, экспрессирующиеся при внесении аллогенной РНК, относятся к антигенам Н-2-комплекса ( рис. 11.8 ).
Возникновение Н-2 антигенов на поверхности культивируемых клеток является результатом активного белкового синтеза de novo, о чем говорят опыты с использованием ингибитора белкового синтеза - циклогексимида ( рис. 11.9 ).
Подводя итог представленным экспериментальным данным, следует обратить внимание на три основные группы фактов.
1. Установление "линейной специфичности" действия РНК: в отмене аллогенной ингибиции колониеобразования активна только РНК гибрида или РНК второго родителя в системе переноса родитель - гибрид.
2. Среди различных классов РНК полноценной активностью в отмене дефекта взаимодействия несингенных клеток обладает класс пре-мРНК ядра.
3. Активность данного класса проявляется в формировании на поверхности культивируемых с РНК клеток Н-2 антигенов, свойственных донору РНК.
Таким образом, следует заключить, что фенотипическая коррекция клеточных взаимодействий в системе колониеобразования связана с антигенной модификацией клеток, вступающих в кооперативные отношения со стромальными элементами хозяина, "сингенизацией" отношений донор- реципиент.
В суммарном виде представленные результаты отражает рис. 11.10 .
