Микроорганизмы: олигонуклеотидные зонды, амплификация
Теоретически можно получить любое количество копий нужного фрагмента нуклеиновой кислоты, его комплекса с олигонуклеотидным зондом и самого олигонуклеотидного зонда. Для этого используют ПЦР , лигазную цепную реакцию, амплификацию с перемещением цепи ДНК ( SDA ) и транскрипционную амплификацию ( TMA ).
При любом из этих методов количество копий нужного фрагмента нуклеиновой кислоты (либо его комплекса с олигонуклеотидным зондом) нарастает в геометрической прогрессии до тех пор, пока не достигнет уровня, доступного определению.
Принцип ПЦР заключается в чередовании циклов гибридизации одноцепочечных ДНК или РНК с мечеными олигонуклеотидными зондами (праймерами), синтеза комплементарной нуклеотидной последовательности с помощью термостабильной ДНК-полимеразы и денатурации образовавшихся двухцепочечных структур путем нагревания. За 20-30 циклов количество копий нужного фрагмента нуклеиновой кислоты достигает нескольких миллионов.
Для определения продукта реакции, как правило, используют хемилюминесценцию.
Чувствительность подобных методик значительно превышает чувствительность традиционных методов идентификации микроорганизмов, в частности культивирования . Однако если в исследуемый материал попадет хотя бы незначительная примесь посторонней ДНК или РНК, результаты исследования могут быть сведены на нет.
В настоящее время имеются готовые диагностические наборы для выявления Mycobacterium tuberculosis и Chlamydia trachomatis с помощью ПЦР. Многие лаборатории используют покупные олигонуклеотидные зонды, термостабильную ДНК-полимеразу и другие реактивы для создания собственных диагностических систем.
В другой группе методов амплификации подвергаются не нуклеиновые кислоты, а сам биологический сигнал . Их суть сводится к тому, чтобы снабдить каждую копию определяемого фрагмента нуклеиновой кислоты как можно большим числом сигнальных молекул. Самый мощный метод из этой группы - метод разветвленной ДНК . В нем используются два олигонуклеотидных зонда. Первый зонд одним концом гибридизуется с ДНК или РНК идентифицируемого микроорганизма, а другим - со специальной искусственно синтезированной молекулой-усилителем, которую называют разветвленной ДНК . Эта молекула напоминает расческу, у которой все "зубья" представлены идентичными последовательностями нуклеотидов, а "ручка" комплементарна первому олигонуклеотидному зонду. Далее в систему добавляют второй зонд, комплементарный к "зубьям" молекулы-усилителя и меченный сигнальным веществом. Усиленный таким образом биологический сигнал улавливают благодаря хемилюминесценции.
Преимущество метода разветвленной ДНК перед ПЦР состоит в его быстроте.
