Анализ гипотезы о компартменизации ATP
Если транспортная функция креатинкиназной системы определяется равновесным положением креатинкиназной реакции, то как быть с компартментацией АТР, которая была показана во многих опытах? Но была ли компартментация АТР действительно показана в этих опытах? Чтобы объяснить опыты Геркена и Шлетте [ Gerken, ea 1968 ] компартментацией АТР, необходимо предположить, что около 80% АТР в сердце прочно связаны и не доступны для обмена и диффузии. Однако такому предположению противоречит целый ряд фактов.
1. Опыты Аррио-Дюпона и Де Нея по фракционированию сердечных клеток лягушки показали, что 90-92% АТР находятся в цитоплазме, а остальная часть - в митохондриях, независимо от функционального состояния клеток [ Arrio-Dupont, ea 1986 ]. Эти данные хорошо согласуются с содержанием АТР в митохондриях сердца теплокровных животных (10-15% от общего содержания) [ La ea 1972 , Kauppinen, ea 1980 ]. В то же время Аррио-Дюпон и соавтор [ Arrio-Dupont, ea 1986 ] нашли, что в цитоплазме присутствуют только около 2,5% ADP , что подтверждает ранее установленный факт [ Veech. ea 1979 , Perry, ea 1952 , Yagi, ea 1960 ], что значительная доля ADP в скелетных мышцах и сердце связана с внутриклеточными структурами.
2. Общее содержание АТР в поперечно-полосатых мышцах и сердце равно 8-10 ммоль/кг сырого веса [ Zeleznikar, ea 1991 , Veech, ea 1978 ], тогда как ADP - порядка 1 ммоль/кг [ Zeleznikar, ea 1991 , Veech, ea 1978 ].
3. С помощью [ Saks, ea 1996 ] обмена было показано, что практически весь гамма- фосфат АТР в мышце диафрагмы метаболически активен независимо от функционального состояния мышцы [ Zeleznikar, ea 1991 ]; в то же время в покое мышцы только 25% ADP метаболически активны [ Zeleznikar, ea 1990 ]. Это означает, что даже если в нативных кардиомиоцитах часть АТР в цитоплазме и связана с растворимыми белками, эта связь не является прочной.
4. Расчеты показывают, что доля АТР цитоплазмы, связанного с растворимыми белками, не может быть велика. Действительно, известно, что в 1 кг мышц содержится 40-50 г водорастворимых белков [ Scopes, ea 1973 , Lehninger, ea 1975 ]. Предположим, что средняя молекулярная масса этих белков равна 50 кДа, тогда их общее содержание составит 0,8- 1,0 ммоль/кг. Если даже предположить, что каждая субъединица этих белков может связать по одной молекуле АТР, то и в этом случае концентрация свободного АТР снизится всего лишь на 10%.
5. В физиологических условиях во время цикла сокращение-расслабление часть АТР может быть связана с миозином. Однако концентрация активных центров миозина в сердце равна 150 мкМ [ Barsotti, ea 1988 ], а в скелетных мышцах - 240 мкМ [ Ebashi. ea 1968 ]. Это дополнительно может дать такое же количество связанного АТР.
6. Определение отношения коэффициентов диффузии АТР и КФ в скелетной мышце и в водном растворе показало, что эти отношения равны и не обнаруживают никаких аномалий по сравнению с отношениями, найденными для ряда других веществ [ Kushmerick, ea 1969 , Hubley. ea 1995 ].
7. Опыты некоторых авторов с [31Р]ЯMP указывают на возможность существования в скелетных и сердечных мышцах ЯМР-невидимого, связанного с матриксом митохондрий пула АТР [ Zahler, ea 1987 ]. Сузуки и соавт. [ Suzuki, ea 1990 ] нашли в сердце крысы пул медленно обмениваемого АТР, который составил около 30% от общего содержания АТР. Авторы предполагают, что этот пул включает АТР митохондрий и, возможно, АТР, связанный с белками цитозоля [ Suzuki, ea 1990 ]. По мнению Вайсмана и Кушмерика, ЯМР-невидимый пул АТР не может превышать 5- 10% от его общего содержания [ Wiesman, ea 1997 ].
Таким образом, результаты, полученные разными авторами и разными методами, свидетельствуют о том, что как минимум 80-90% АТР цитоплазмы находятся в свободном состоянии. Если большая часть АТР в мышечных клетках находится в свободном состоянии, то возможно ли возникновение в метаболических компартментах около миофибрилл и в межмембранном пространстве митохондрий локальной концентрации АТР, существенно отличающейся от его средней рассчитанной концентрации в цитоплазме? Частичный ответ на этот вопрос дают опыты, проведенные на изолированных митохондриях сердца. Геллерих и соавт. [ Gellerich, ea 1994 ] показали, что во время окислительного фосфорилирования в среде, содержащей фосфоенолпируват и 300-кратный по отношению к окислительному фосфорилированию избыток активности пируваткиназы, при работе мт-КК в межмембранном пространстве возникают локальные концентрации АН, причем максимальная величина градиента концентраций между межмембранным пространством и средой была порядка 13 мкМ [ Gellerich, ea 1994 ]. На такую величину концентрация ADP в межмембранном пространстве была выше, а концентрация АТР -ниже, чем в среде. Концентрация свободного ADP в цитоплазме мышечных клеток равна приблизительно 30 мкМ [ Veech. ea 1979 ], поэтому увеличение на 13 мкМ представляет собой увеличение концентрации ADP больше чем на 30%: в то же время для АТР этот градиент ничтожно мал [ Gellerich, ea 1994 ]. Очень близкая величина градиента концентрации ADP между межмембранным пространством и наружным раствором (12-13 мкМ) была найдена при изучении аденилаткиназной реакции в митохондриях печени и сердца [ Laterveer, ea 1996 , Gellerich, ea 1992 ]. Опыты с мт-КК были воспроизведены недавно на скинированных волокнах сердца [ Kay, ea 2000 ]. В лаборатории Бессмана и др. было показано [ Lipskaya. T.Yu., Geiger. P.J. 1995 ], что при концентрации АТР в среде около 500 мкМ. степень его компартментаиии в активном центре мт-КК во время окислительного фосфорилирования не превышает 10-12%. Таким образом, уже при концентрации АТР в среде порядка 500 мкМ диффузионные ограничения не могут привести к сколько-нибудь существенной компартментации АТР в межмембранном пространстве митохондрий. На это можно возразить, что in vivo градиент концентрации АН между межмембранным пространством и цитоплазмой может быть выше, чем это найдено в опытах in vitro. Действительно, КmADP окислительного фосфорилирования в изолированных митохондриях сердца равна 20-30 мкМ [ Gellerich, ea 1998 ]. В то же время было найдено, что КmADP окислительного фосфорилирования в скинированных волокнах сердца и медленных скелетных мышц равна 300-400 мкМ [ Kuznetsov, ea 1996 ], и это было объяснено существованием в цитоплазме особого белка, который снижает проницаемость наружной мембраны митохондрий для ADP и который утрачивается в процессе выделения митохондрий [ Kuznetsov, ea 1996 , Волощук ea 1998 ]. Это явление наблюдалось в скинированных мышечных волокнах сердца разных видов животных [ Ventura-Clapier, ea 1998 , Kaasik, ea 1999 ]. Геллерих и соавт. [ Gellerich, ea 1998 ] показали, что при добавлении в среду ннкубации митохондрий сердца крысы 15% декстрана, имитирующего онкотическое давление цитоплазмы, КmADP окислительного фосфорилирования увеличивается с 16 до 50 мкМ. Авторы полагают, что КmADP для окислительного фосфорилирования в интактных сердечных клетках должна быть порядка 50 мкМ и что величины, найденные в скинированных мышечных волокнах, могут быть завышены в связи со сложной структурой этой модели [ Gellerich, ea 1998 ]. В то же время Фром и соавт. [ From, ea 1990 ] показали на перфузируемом сердце крысы, что КmADP для окислительного фосфорилирования равна 25 мкМ в условиях, когда скорость продукции NADH не является фактором, лимитирующим дыхание. На скинированных волокнах быстрых скелетных мышц величина КmADP окислительного фосфорилирования также не отличалась от таковой для изолированных митохондрий [ Ventura-Clapier, ea 1998 , Kuznetsov, ea 1996 ].
Как бы то ни было, найденные различия [ Ventura-Clapier, ea 1998 , Gellerich, ea 1998 , Kuznetsov, ea 1996 , Kaasik, ea 1999 ] все еще лежат в области микромолярных концентраций, поэтому можно думать, что в физиологических условиях градиент концентрации между межмембранным пространством и цитоплазмой может быть существенен для ADP , но не для АТР, КФ или Кр. Компартмент в межмембранном пространстве митохондрий поддерживается не только за счет существования неперемешиваемых слоев и белок-белковых взаимодействий, как это можно ожидать в случае метаболических компартментов, образованных белками цитоплазмы, в том числе около миофибрилл, но и за счет ограниченной проницаемости наружной мембраны, о чем более подробно будет сказано позже. В связи с этим можно предположить, что градиент концентрации АН , который могут поддерживать гипотетические метаболические компартменты в цитоплазме, также будет лежать в области микромолярных концентраций. Так, было показано, что в присутствии декстрана диффузионный градиент ADP между компартментом, образованным связанной с наружной поверхностью наружной мембраны митохондрий гексокиназой , и наружной средой равен ~12 мкМ [ Laterveer, ea 1997 ]. Как же, если не компартментацией АТР, можно объяснить опыты, в которых было показано, что при ингибировании КК или при истощении КФ сердечная мышца перестает сокращаться, хотя содержание АТР снижается только на 10-20% [ Gerken, ea 1968 , Gudbjarnason, ea 1970 ]?
Одной из наиболее вероятных причин утомления в этом случае является, по-видимому, увеличение концентрации ADP . Действительно, если стационарные концентрации свободных АТР и ADP в кардиомиоцитах равны соответственно 10 мМ и 30 мкМ, то гидролиз 10% АТР при неработающей креатинки-назной системе должен приводить к 30-кратному увеличению концентрации ADP, ингибитора миофибриллярной АТРазы. Роль MgADP в развитии диастолической дисфункции была проанализцропана в недавней работе Тиан и соавт. [ Tian, ea 1997 ]. Известно, что сердце более чувствительно к снижению концентрации АТР, чем скелетные мышцы. Этот факт хорошо коррелирует с величинами КmADP у актомиозина сердца и скелетных мышц: 10 и 170 мкМ соответственно [ Ventura-Clapier, ea 1994 ]. Среди других факторов могут иметь значение локальное закисление и накопление Р, [ Ventura-Clapier, ea 1994 ]. Что касается опытов, выполненных на изолированных миофибриллах и на скинированных мышечных волокнах [ Bessman, ea 1980 , Savabi, ea 1983 , Saks, ea 1984 , Veksler, ea 1984 , Ventura-Clapier, ea 1985 ], в которых было показано, что присутствие креатинкиназной системы значительно улучшает все параметры сокращения, то следует отметить, что это модели с большими диффузионными расстояниями [ Meyer, ea 1984 ], поэтому результаты этих опытов могут оыть объяснены не компартментацией АН, а тем, что в этих опытах креатинкиназная система ускоряла обмен макроэргического фосфата по механизмуу описанному Мейером и соавт. [ Meyer, ea 1984 ], причем и одних случаях [ Savabi, ea 1983 , Veksler, ea 1984 , Ventura-Clapier, ea 1985 ] решающее значение имело, по-видимому, снижение стационарной концентрации ADP и общее ускорение транспорта макроэргического фосфата, а в других [ Bessman, ea 1980 ] - то, что транспорт макроэргического фосфида осуществлялся главным образом в виде молекул КФ. Сторонники идеи о компартментации АТР в подтверждение своей точки зрения часто ссылаются па работы Джонса и соавт. [ Aw, ea 1985 , Jones, ea 1986 ]. Между тем в этих работах речь идет не о компартментации АТР, а о диффузионном градиенте концентрации этого вещества, возникающем в клетках печени после общего снижения концентрации АТР, вызванного специальными воздействиями (гипоксия и др.) [ Aw, ea 1985 ]. По мнению самого Джонса [ Jones, ea 1986 ] в нормальных аэробных условиях градиенты концентрации АТР не могут быть значительными, учитывая высокую внутриклеточную концентрацию этого вещества. Говоря о возможных последствиях компартментации АТР для метаболизма, рискнем провести аналогию между биоэнергетикой и макроэнергетикой. В биоэнергетике АТР является универсальным источником энергии; аналогичную роль в экономике выполняет электроэнергия. В странах с развитой экономикой отдельные источники электроэнергии объединяют в единую электроэнергетическую систему, что обеспечивает рациональное использование материальных ресурсов и энергии. В биоэнергетике такому принципу организации соответствует представление о свободном состоянии АТР в цитоплазме и о равной доступности всего пула цитоплазменного АТР всем расположенным в этом компартменте потребляющим АТР системам. Принцип компартментации АТР, перенесенный на макроэнергетику, можно сформулировать так: "каждый потребитель энергии должен иметь свою электростанцию" или он может означать, что потребители энергии получают ее по принципу конкурсного отбора. Интересно, что в мышцах видны признаки существования "единой энергетической системы" в виде митохондриального ретикулума [ Bakeeva, ea 1978 ].
Известно, что АТРазы имеют очень низкую величину КmMgATP по сравнению с концентрацией АТР в цитоплазме. Из этого факта был сделан вывод, что высокая концентрация АТР вообще не важна для функции мышц [ Saks, ea 1994 ]. Однако, с другой стороны, насыщение в физиологических условиях активных центров ферментов АТР может означать, что энергетика нормально функционирующей мышечной ткани организована таким образом, что источник энергии - АТР не является лимитирующим фактором.
