Гипотеза о сопряжении мт-креатинкиназы и ТАН: анализ
Проанализируем весомость приведенных выше аргументов в пользу существования структурно- функционального сопряжения между мт-КК и ТАН. Недостатком кинетических доказательств является то, что результаты сильно зависят от условий эксперимента и, как правило, не позволяют однозначно трактовать полученные данные. Так, Альтшульд и Брайерли [ Altshuld, ea 1977 , Altshuld, ea 1980 ], а также Боррибек [ Borrebaek, ea 1980 , Borrebaek, ea 1985 ] показали, что снижение скорости синтеза КФ в присутствии олигомицина , которое наблюдали Сакс и соавт. [ Saks, ea 1975 , Saks. ea 1976 ], связано с повышением концентрации ADP в среде инкубации. Добавление в среду большого избытка пируваткиназы в присутствии фосфоенолпирувата устраняло ингибирующий эффект олигомицина [ Altshuld, ea 1977 , Altshuld, ea 1980 , Borrebaek, ea 1980 , Borrebaek, ea 1985 ]. Экстраполяция к неопределенной концентрации пируваткиназы дает скорость синтеза КФ, превышающую скорость, определенную для фосфорилирующих митохондрий [ Altshuld, ea 1980 ]. Липская и соавт., применившие рН-метрическую регистрацию начальной скорости синтеза КФ митохондриями в присутствии олигомицина, также нашли, что она превышает скорость синтеза КФ во время окислительного фосфорилирования [ Lipskaya. ea 1995 ]. В опытах на трансгенных мышах, лишенных ММ-КК, методом [31P]ЯMP было показано, что поток через мт-КК намного превышает максимальную скорость дыхания митохондрий [ Nicolay, ea 1998 ]. Снижение КmMgATP во время окислительного фосфорилирования может иметь самые разные причины. Например, оно может быть отчасти обусловлено тем, что во время окислительного фосфорилирования часть мт-КК сходит с мембран в межмембранное пространство и/или часть октамеров диссоциирует до димеров, так как эти переходы также сопровождаются сходными изменениями кинетических параметров фермента [ Lipskaya, ea 1982 , Lipskaya. ea 1989 ]. Уменьшение во время окислительного фосфорилирования величины отрицательного заряда на поверхности внутренней мембраны митохондрий также может внести свой вклад в снижение Кm для отрицательно заряженного MgATP [ Wojtczak, ea 1979 ].
КС1 не является специфическим агентом для солюбилизации мт-КК. Многие вещества могут солюбилизировать фермент [ Липская ea 1980 , Wenger, ea 1985 , Brooks, ea 1987 , Van_Dorsten, ea 1998 ], причем эффект зависит не от химической природы веществ, а от ионной силы их растворов [ Липская ea 1980 , Wenger, ea 1985 , Brooks, ea 1987 ]. Если в присутствии КСl функциональное сопряжение мт-КК и ТАН исчезает, то это ставит под сомнение возможность существования такого сопряжения in vivo, в условиях физиологической ионной силы. К сожалению, выбор КС1 в качестве солюбилизирующего агента не был удачным, так как Сl- служит конкурентным ингибитором для MgATP как цитоплазматической [ Nichei, ea 1961 ], так и мт-КК [ Hall, ea 1979 ], поэтому увеличение KmMgATP присутствии КС1 [ Kuznetsov, ea 1989 ] могло быть связано и с ингибирующим действием С1-.
Более прямой ответ на вопрос о существовании структурно-функционального сопряжения между мт-КК и ТАН может быть получен при изучении степени компартментаиии АТР в области активного центра мт-КК во время окислительного фосфорилирования с использованием радиоизотопного метода [ Erickson-Viitanen, ea 1982 , Lipskaya. ea 1995 , Altshuld, ea 1977 , Липская ea 1980 ]. В этих опытах митохондрии инкубировали короткое время в среде, обеспечивающей протекание окислительного фосфорилирования и креатин-киназной реакции, в присутствии немеченого АТР и меченого Рi. В ходе окислительного фосфорилирования образовывался меченый АТР. Путем сравнения степени включения метки в наружный раствор АТР и во вновь синтезированный КФ можно было оценить прямой вклад образованного во время окислительного фосфорилирования АТР в синтез КФ, т.е. оценить степень компартментации АТР в области активного центра мт-КК [ Erickson-Viitanen, ea 1982 ]. Следовало ожидать, что если обмен АН между активными центрами мт-КК и ТАН связан с их прямой передачей в пределах комплекса мт-КК-ТАН, то степень компартментации АТР в активном центре мт- КК не должна зависеть от концентрации наружного раствора АТР и должна быть равна 100% или по крайней мере она должна возрастать с увеличением скорости окислительного фосфорилирования, которое происходит, например, при увеличении концентрации АТР в среде инкубации с Кр. Между тем изотопные опыты группы Бессмана [ Erickson-Viitanen, ea 1982 ] показали, что степень компартментации снижается с увеличением концентрации АТР и что максимальная степень компартментации (при экстраполяции концентрации АТР к нулю) равна только 50% ( рис. 3 ). Аналогичные результаты были получены при изучении зависимости степени компартментации ADP в активном центре мт-КК от концентрации ADP [ Barbour, ea 1984 ]. Эти данные указывают на отсутствие прямой передачи АН в области активных центров двух белков и могут быть объяснены наличием диффузионных ограничений в их окружении, которые проявляют себя тем больше, чем ниже концентрации АТР и ADP, что и приводит к увеличению степени компартментации АН в активном центре мт-КК при снижении концентрации АН в среде. Разрушение наружной мембраны митохондрий дигитонином устраняло компартментацию, наблюдавшуюся при низких концентрациях АТР [ Erickson-Viitanen, ea 1982 ]. Так как эти опыты проводились в среде с низкой ионной силой и в течение очень коротких промежутков времени (5-10 с), то устранение компартментации нельзя было объяснить солюбилизацией мт-КК с мембран митохондрий или диссоциацией октамера на димеры. Был сделан вывод, что прямой обмен АН между мт-КК и ТАН отсутствует, а компартментация обусловлена существованием барьера проницаемости для АН в виде наружной мембраны митохондрий [ Erickson-Viitanen, ea 1982 ]. Другие изотопные опыты [ Lipskaya. ea 1995 , Altshuld, ea 1977 , Липская ea 1980 ] также свидетельствуют об отсутствии компартмента АН, ограниченного комплексом мт-КК-ТАН. В опытах Геллериха и соавт. одинаковые градиенты концентрации ADP между межмембранным пространством и наружной средой были достигнуты как при работе мт-КК, так и митохондриальной аденилаткиназы [ Gellerich, ea 1994 , Laterveer, ea 1996 , Gellerich, ea 1992 , Laterveer, ea 1997 ]. Аденилаткиназа является растворимым белком межмембранного пространства и не связана с мембранами митохондрий [ Brdiczka, ea 1990 ]. Эти опыты указывают на то, что мт-КК и аденилаткиназа находятся в едином компартменте, ограниченном мембранами митохондрий, и что дополнительные диффузионные барьеры между двумя ферментами внутри этого компартмента отсутствуют. Еще одна трудность для прямого обмена нуклеотидами заключается в том, что субстратами для мт-КК служат магниевые комплексы АН, а для ТАН - свободные нуклеотиды [ Vignais. ea 1976 ]. Описанные выше термодинамические опыты [ De_Furia, ea 1980 , Saks, ea 1985 , Sobol, ea 1994 ] трудно анализировать, так как в указанных работах отсутствует информация о характере изменения во времени концентрации всех участников креатинкиназной реакции. В связи с этим в группе автора данной статьи были поставлены опыты, в которых были прослежены эти изменения (результаты готовятся к публикации). Условия экспериментов были близки к условиям Собол и соавт. [ Sobol, ea 1994 ]. Эти опыты показали, что превышение отношения действующих масс креатинкиназной реакции над Ккаж достигается не за счет увеличения концентрации КФ, как предполагает гипотеза о структурно-функциональном сопряжении, а за счет увеличения концентрации ADP в среде в то время, когда концентрация КФ уже перестает увеличиваться. Это увеличение происходило в одинаковой степени как в присутствии, так и в отсутствие Кр и было обусловлено АТРазной активностью митохондрий, которая увеличивалась с увеличением времени инкубации. Ряд косвенных данных позволяет предположить, что в цитированных выше работах [ De_Furia, ea 1980 , Saks, ea 1985 , Sobol, ea 1994 ] превышение отношения действующих масс участников креатинкиназной реакции над Ккаж могло быть достигнуто также за счет АТРазной активности. Так, в обсуждаемых работах были использованы митопласты с явно увеличенной по сравнению с исходными митохондриями АТРазной активностью [ Saks, ea 1985 ], рис. 2 и/или длительные времена инкубации: 20-60 мин [ Sobol, ea 1994 ] и 120-160 мин [ De_Furia, ea 1980 ]. Известно, что длительная инкубация митохондрий,и особенно митопластов, при повышенных температурах (30-37градусов) приводит к их набуханию и разобщению окисления от фосфорилирования, что сопровождается стимуляцией АТРазной активности. Последняя реакция является необратимой и приводит к снижению концентрации АТР и к накоплению ADP. Как следствие, отношение действующих масс участников креатинкиназной реакции, измеренное в этот период, оказывается выше Ккаж этой реакции, хотя механизм явления не имеет ничего общего с функциональным сопряжением мт-КК и ТАН. В контрольных опытах в указанных работах были использованы известные ингибиторы окислительного фосфорилирования - олигомицин и карбоксиатрактилозид [ Saks, ea 1985 , Sobol, ea 1994 ]. Однако они же являются ингибиторами митохондриальной АТРазы, поэтому не удивительно, что в их присутствии отношение действующих масс участников креатинкиназной реакции возвращалось к величине Ккаж. Другие из использованных контролей - анаэробиоз [ Sobol, ea 1994 ] и добавление цианида [ De_Furia, ea 1980 ] - не только подавляют дыхание, но ингибируют ATРазу митохондрий, хотя механизм их действия непрямой [ Ленинджер ea 1966 ]. Таким образом, анализ кинетических и термодинамических аргументов, приводимых в доказательство справедливости гипотезы Сакса-Джекобуса, показывает, что они не позволяют однозначно трактовать полученные результаты. В то же время наиболее прямые опыты по изучению степени компартментации АТР и ADP в активном центре мт-КК с использованием радиоактивной метки [ Erickson-Viitanen, ea 1982 , Altshuld, ea 1977 , Липская ea 1980 , Barbour, ea 1984 , Erickson-Viitanen, ea 1982 ] и ряд других данных [ Gellerich, ea 1994 , Laterveer, ea 1996 , Gellerich, ea 1992 , Laterveer, ea 1997 ] свидетельствуют против структурно-функционального сопряжения мт-КК и ТАН. Что касается структурных данных, положенных в основу гипотезы Валлиманна-Брдички, то, прежде всего, образование комплексов белков еще не доказывает существования прямого переноса метаболитов и даже их компартментацию внутри комплекса. Более того, взаимодействие ферментов в комплексе может индуцировать изменения в их третичной и четвертичной структуре, что может найти свое отражение в изменении их кинетических параметров и может быть интерпретировано как проявление прямого обмена субстратами без существования этого явления в действительности. Попытки сшить постулированные белковые комплексы в момент их образования с помощью различных сшивающих агентов оказались безуспешными [ Schnyder, ea 1994 ]. Было показано, что порин и ТАН распределены по поверхности соответственно наружной и внутренней мембран случайным образом [ Brdiczka, ea 1991 , Kottke, ea 1991 ]. По данным гистохимического и иммунологического методов электронной микроскопии, мт-КК расположена как в местах контакта наружных мембран [ Schlegel, ea 1988 , Biermans, ea 1990 ], так и на мембранах крист [ Schlegel, ea 1988 , Baba, ea 1976 ]. Липская и соавт. путем сшивания мт-КК с мембранами митохондрий с помощью глутарового альдегида показали, что в митохондриях есть два типа участков локализации мт-КК, между которыми активность фермента распределена в отношении 1 : 1 [ Lipskava. ea 1989 ], поэтому можно думать, что в контактных участках присутствуют не более 50% молекул мт-КК. На существование двух разных участков локализации мт-КК, находящихся в соотношении 1:1, указывают и изотопные опыты по определению степени компартментации АТР и ADP в активном центре мт-КК, где было показано, что максимальная степень компартментации равна 50% [ Erickson-Viitanen, ea 1982 , Barbour, ea 1984 ]. Последние данные свидетельствуют также о том, что в непосредственной близости от ТАН находятся не более 50% мт-КК. Вполне может быть, что это мт-КК. расположенная только в контактных участках или только на мембранах крист. В митохондриях сердца крысы содержание октамеров мт-КК равно 0,125 нмоль/мг белка [ Saks, ea 1994 ], димеров ТАН - 1,27 нмоль/мг белка [ Saks, ea 1994 ], димеров порина - 0,35 нмоль/мг белка [ Gellerich, ea 1994 ].
Таким образом, содержание октамеров мт-КК в 10 раз меньше, чем содержание димеров ТАН, и в 3 раза меньше, чем димеров порина. В то же время один октамер мт-КК кинетически может обслужить 40-50 молекул ТАН [ Schlegel, ea 1988 ]. Если предположить, что мт-КК "собирает" АТР от большого числа транслоказ в результате прямого, хотя бы и кратковременного, взаимодействия [ Schnyder, ea 1988 ], то для этого необходима очень энергичная латеральная диффузия этих молекул и наличие какого-то механизма, который бы обеспечивал правильную ориентацию молекул во время соударения. Между тем внутренняя мембрана митохондрий построена в основном из белков [ Sjosirand. ea 1978 , Satersdai. ea 1978 , Fleischer. ea 1976 ] и обладает высокой вязкостью, затрудняющей диффузию. Наконец, было установлено, что активные центры мт-КК обращены не в полость центрального канала, как предполагалось [ Schnyder, ea 1988 ], а расположены по периферии молекулы [ Schnyder. ea 1995 ]. В связи со всем сказанным представляется, что если число молекул ТАН, так же как и число пор в наружной мембране митохондрий, много больше числа молекул мт-КК и в то же время число оборотов одной молекулы мт-КК много больше числа оборотов ТАН, успешное функционирование отдельных элементов системы не требует такого их структурного взаимодействия. которое бы обеспечивало прямую передачу АН между их активными центрами. Достаточным может оказаться их расположение в одном компартменте - межмембранном пространстве митохондрий. В этом случае, конечно. АН должны перемещаться между активными центрами этих белков путем диффузии.
Таким образом, в настоящее время не известно ни одного факта, который бы однозначно свидетельствовал в пользу рассмотренных гипотез. В то же время имеется много фактов, которые им противоречат. Локализация мт-КК.в контактных участках мембран митохондрий и способность октамера взаимодействовать с обеими пограничными мембранами может указывать на участие октамера в формировании контактных участков и в регуляции проницаемости наружной мембраны для метаболитов. Было показано, что димер мт-КК гораздо слабее взаимодействует с наружной мембраной [ Rojo, ea 1991 , Schlegel. ea 1990 ], и высказано предположение, что обратимые взаимные переходы октамера и димера могут играть регуляторную роль в формировании межмембранных контактов [ Kottke, ea 1991 ].
Таким образом, возможно, что помимо каталитической функции мт-КК, наряду с другими белками, выполняет структурную роль в области контактов пограничных мембран [ Fritz-Wolf, ea 1996 ]. Опосредованно, через участие в образовании контактов, мт-КК может участвовать в регуляции проницаемости пор [ Brdiczka, ea 1998 , Beutner. ea 1998 ].
