Влияние различных лигандов РНКП на связывание аптамеров
Установлено, что рифампицин (Rif) связывается внутри главного канала РНК-полимеразы (РНКП) вблизи от активного центра РНКП ( Artsimovitch et al., 2005 ; Campbell et al., 2001 ). Сигма-субъединица также связывается с кор-ферментом РНКП со стороны главного канала (выше по ходу транскрипции относительно активного центра фермента) ( Vassylyev et al., 2002 ). Фактор GreB связывается в области вторичного канала РНКП, в районе, удаленном от сайтов связывания аптамеров; функцией данного фактора является активация расщепления РНК в активном центре РНКП ( Vassylyeva et al., 2007 ). Было показано, что все три лиганда способны подавлять взаимодействие различных аптамеров с РНКП . Rif по-разному влияет взаимодействие аптамеров с РНКП. Связывание некоторых аптамеров (Е1-Е3 в случае РНКП E. coli, Т2, Т3 и Т5 в случае РНКП T. aquaticus - см. " Общая характеристика аптамеров ") нечувствительно к Rif, в то время как связывание остальных (в том числе, всех аптамеров - Е5-Е13, - отобранных в эксперименте по Rif-направленному отбору к РНКП E. coli) эффективно подавляется антибиотиком . Сигма-субъединица ингибирует связывание большинства аптамеров с кор- ферментом и в случае РНКП E. coli, и в случае РНКП T. aquaticus, кроме аптамера Т5, связывание которого не подавляется сигма-субъединицей. GreB способен подавлять связывание некоторых из аптамеров с РНКП E. col (в частности, Е4, Е9, Е10, Е12), но достаточно слабо влияет (или не влияет совсем) на связывание аптамеров других классов (например, Е1, Е7).
На основе вычисленых Кд для связывания различных лигандов с РНКП показано, что аффинность Rif к РНКП T. aquaticus оказывается примерно в 300 раз меньше, чем к РНКП E. coli. Это согласуется с имеющимися в литературе данными о том, что РНКП T. aquaticus гораздо менее чувствительна к данному антибиотику, чем РНКП E. coli ( Campbell et al., 2001 ). Показано также, что сигмаA-субъединица обладает несколько большей аффинностью к кор-РНКП T. aquaticus, чем сигма70-субъединица к РНКП E. coli. В то же время, нельзя исключить, что данное различие связано с тем, что в случае РНКП E. coli измерения проводились при более высокой ионной силе, что могло приводить к ослаблению контактов сигма с кор-ферментом.
Для выяснения механизма, по которому различные лиганды РНКП подавляют связывание аптамеров, была измерена кинетика диссоциации комплексов аптамеров с РНКП E. coli в присутствии Rif, сигма-субъединицы и фактора GreB. Было установлено, что скорость диссоциации РНКП-аптамерных комплексов оказывается одинаковой, если в качестве конкурентного лиганда используется сам аптамер, минимальная матрица, Rif или сигма-субъединица . Так как Rif и сигма не влияют на кинетику диссоциации комплексов аптамеров с РНКП, можно утверждать, что эти факторы, вероятно, напрямую конкурируют с аптамерами за один и тот же сайт связывания. Это согласуется с тем, что сайты связывания Rif и сигма находятся внутри главного канала РНКП и, вероятно, перекрываются с сайтами связывания аптамеров. В то же время, GreB вызывает активную диссоциацию РНКП-аптамерных комплексов. Это позволяет утверждать, что данный фактор вызывает определенные конформационные изменения внутри главного канала РНКП, затрагивающие сайты связывания аптамеров, что приводит к их диссоциации. Так как сайт связывания GreB располагается со стороны вторичного канала РНКП и, по-видимому, не перекрывается с сайтами связывания аптамеров, данные изменения должны происходить по аллостерическому механизму. Можно надеяться, что дальнейшие исследования структуры комплекса РНКП с Gre-факторами позволят установить механизмы этих изменений и их роль в стимуляции нуклеазной активности РНКП Gre-факторами.
