Методы отбора аптамеров: использование модифицированных нуклеотидов
Проведение отбора in vitro позволяет использовать олигонуклеотиды, в состав которых введены химически-модифицированные нуклеотиды. Модификации вносятся в 2'-положение нуклеотидов, в 5-положение пиримидинов, 7- и 8-положение пуринов и др. (подробное описание различных модификаций можно найти в обзорах ( Eaton, 1997 ; Eaton and Pieken, 1995 ; Kusser, 2000 ; Копылов and Спиридонова, 2000 )). Существует два альтернативных подхода к получению модифицированных аптамеров.
В первом из них модифицированные олигонуклеотиды используются непосредственно при проведении отбора. Главное ограничение в этом случае заключается в том, что модификация не должна значительным образом влиять на способность нуклеотида служить субстратом для РНК- или ДНК- полимеразы.
При втором подходе изменениям подвергаются уже полученные аптамеры. При этом значительно увеличивается разнообразие доступных модификаций (так как нет ограничения на их совместимость с энзимологией синтеза РНК и ДНК), однако, многие изменения могут приводить к уменьшению сродства аптамеров к их мишеням. В связи с этим приходится проводить поиск модификаций, не влияющих на взаимодействие аптамера с мишенью.
Модификации вносятся для достижения следующих целей.
- Введение различных модификаций значительно увеличивает потенциальное разнообразие олигонуклеотидов; считается также, что дополнительные функциональные группы могут обеспечить большее количество контактов между аптамерами и их мишеням, что должно способствовать получению аптамеров с большей аффинностью и специфичностью к своим мишеням ( Eaton, 1997 ; Uphoff et al., 1996 ; Wilson and Szostak, 1999 ).
- Многие модификации аптамеров (особенно в 2'-положении рибозы при введении F- или NH2-группы) делают их устойчивыми к воздействию нуклеаз, что имеет огромное значение при использовании аптамеров в диагностических и терапевтических целях ( Eaton, 1997 ; Jayasena, 1999 ; Nimjee et al., 2005 ). Одним из способов получения аптамеров, устойчивых к воздействию нуклеаз, является использование зеркальных аналогов природных нуклеотидов (на основе L-рибозы или L-дезоксирибозы). Данные аптамеры получили название шпигельмеров (от нем. spiegel - зеркало), а метод их отбора был назван "зеркальным" SELEX (mirror-image SELEX) ( Vater and Klussmann, 2003 ). Так как РНК- и ДНК-полимеразы не способны осуществлять полимеризацию L-нуклеотидов, то отбор в этом случае производится стандартным образом (с использованием D-нуклеотидов), но в качестве мишени используется энантиомер природного соединения (например, пептид, состоящий из D-аминокислот). После определения первичной структуры полученных аптамеров синтезируется L-вариант олигонуклеотида, который по законам симметрии оказывается способен взаимодействовать с природной мишенью (например, L-пептидом) ( Vater et al., 2003 ; Vater and Klussmann, 2003 ; Wlotzka et al., 2002 ). Олигонуклеотиды, состоящие из L-нуклеотидов, обладают очень высокой стабильностью, так как не узнаются природными нуклеазами.
- Использование при отборе модифицированных олигонуклеотидов, содержащих функциональные группы, которые могут быть активированы при облучении (например, 5-йод-, 5-бром и 4-тио-уридин), позволяет получить аптамеры, способные к образованию ковалентных сшивок с белком-мишенью (так называемые фотоаптамеры ) ( Golden et al., 2000 ; Jensen et al., 1995 ). При этом в каждом раунде отбора производится облучение комплексов олигонуклеотидов с белком-мишенью ультрафиолетовым светом и отбор последовательностей, образовавших сшивку (например, при помощи электрофореза в денатурирующих условиях). Метод получения фотоаптамеров получил название " ковалентного" SELEX (covalent SELEX). Использование фотоаптамеров значительно повышает специфичность узнавания белка-мишени, так как для образования сшивки кроме простого связывания аптамера с белком необходимо правильное взаимное расположение участков нуклеиновой кислоты и белка, образующих сшивку ( Petach and Gold, 2002 ; Smith et al., 2003 ). Технология получения аптамеров, способных к образованию ковалентных сшивок с белками-мишенями, используется в для создания микрочипов для анализа экспрессии различных белков человека ( Bock et al., 2004 ; Golden et al., 2000 ).
- Внесение в состав аптамера флуоресцентных групп используется для анализа его связывания с белком-мишенью ( Nutiu and Li, 2005 ). Наибольшее значение это имеет при использовании аптамеров для детекции различных молекул-мишеней. В простейшем случае связывание можно детектировать по изменению флуоресценции аптамера, которое вызывается изменениями окружения флуоресцентной группы при образовании комплекса. Кроме того, разработаны методы, позволяющие направленно отбирать аптамеры, флуоресценция которых изменяется при связывании с молекулой- мишенью ( Hamaguchi et al., 2001 ; Nutiu and Li, 2005 ; Stojanovic et al., 2001 ; Yamamoto et al., 2000a ).
