Методы отбора аптамеров: общая схема
Для отбора аптамеров используют комбинаторные библиотеки олигонуклеотидов, которые содержат центральный район со случайной последовательностью, окруженный двумя районами с фиксированными последовательностями ( Рис. 6.1 ). Фиксированные последовательности необходимы для амплификации библиотеки при проведении отбора. оцДНК -библиотеку получают стандартными методами синтеза однонитевых олигонуклеотидов, при синтезе случайного района в реакцию добавляют смесь всех четырех производных дезоксирибонуклеотидов. Для получения РНК-библиотеки в 5'-концевую область оцДНК-библиотеки вводят промоторную последовательность для РНК-полимеразы бактериофага T7, при помощи ПЦР получают дцДНК и проводят транскрипцию in vitro.
Ключевой стадией отбора аптамеров является разделение комплексов олигонуклеотидов с молекулой-мишенью и несвязавшихся олигонуклеотидов. В экспериментах по отбору аптамеров к белкам для этого используют несколько основных методов.
- Белок-мишень иммобилизуют на каком-либо аффинном сорбенте; несвязавшиеся олигонуклеотиды удаляют промывкой буферным раствором, а связавшиеся элюируют и используют для дальнейшего отбора ( Bock et al., 1992 ).
- Комплексы белка с олигонуклеотидами сорбируют на нитроцеллюлозных фильтрах (нитроцеллюлоза неспецифически связывает белки, но не взаимодействует с нуклеиновыми кислотами) ( Schneider et al., 1992 ; Tuerk and Gold, 1990 ).
- Комплексы белка с олигонуклеотидами отделяют от свободных олигонуклеотидов при помощи гель-электрофореза в неденатурирующих условиях ( Triqueneaux et al., 1999 ).
- Смесь олигонуклеотидов с белком-мишенью разделяют при помощи электрофореза в капиллярах (без использования гелей) ( Berezovski et al., 2005 ; Drabovich et al., 2005 ; Mendonsa and Bowser, 2004 ).
- При использовании в качестве мишеней различных макромолекулярных объектов (клеток, вирусов) комплексы со связанными олигонуклеотидами отделяют от несвязавшихся последовательностей при помощи центрифугирования ( Blank et al., 2001 ; Cerchia et al., 2005 ; Homann and Goringer, 1999 ).
Иногда в ходе одной процедуры SELEX чередуют несколько способов отбора, что увеличивает эффективность селекции и позволяет избежать отбора последовательностей, взаимодействующих с используемым при отборе сорбентом или с примесными белками в препарате белка-мишени. Кроме того, для подавления отбора последовательностей, специфически связывающихся с сорбентом, библиотеку перед каждым раундом отбора инкубируют с сорбентом в отсутствие белка-мишени, что позволяет исключить данные последовательности из отбора.
После проведения каждого раунда отбора последовательности, связавшиеся с молекулой-мишенью, амплифицируются с использованием праймеров, соответствующих фиксированным областям библиотеки. В случае РНК-аптамеров этой стадии предшествует реакция обратной транскрипции. Амплифицированная дцДНК используется для получения обогащенной библиотеки однонитевых олигонуклеотидов, которая затем используется в следующем раунде отбора. При отборе РНК-аптамеров обогащенную РНК- библиотеку получают при помощи транскрипцию in vitro. оцДНК может быть получена несколькими методами:
- в один из праймеров, используемых для амплификации, вносят остаток биотина, цепи ДНК разделяют в денатурирующих условиях на колонке со стрептавидином ( Murphy et al., 2003 );
- оцДНК получают в реакции асимметричной ПЦР в условиях большого избытка одного из праймеров ( Ellington and Szostak, 1992 );
- на 5'-конец одного из праймеров вносят какие-либо химические группы (например, несколько остатков биотина, флуоресцентные красители и др.), что позволяет разделить две цепи ДНК по размеру при помощи электрофореза в денатурирующих условиях ( Morris et al., 1998 );
- в 5'-конец одного из праймеров вносится фосфатная группа, и дцДНК, полученная после амплификации, обрабатывается экзонуклеазой фага лямбда, которая расщепляет фосфорилированную цепь ДНК ( Fitter and James, 2005 ).
В результате отбора происходит постепенное обогащение библиотеки последовательностями, обладающими повышенным сродством к мишени. Обычно в ходе успешного отбора аффинность библиотеки к мишени повышается на несколько порядков.
В среднем для получения аптамеров бывает достаточно провести 5 - 15 раундов отбора. Однако, в некоторых случаях значительное обогащение библиотеки последовательностями, специфичными для белка-мишени, становится заметным уже после первых раундов отбора ( Berezovski et al., 2005 ; Bianchini et al., 2001 ; Fitter and James, 2005 ). Когда аффинность перестает увеличиваться, обогащенную библиотеку клонируют и проводят определение последовательностей индивидуальных аптамеров. Характеристики аптамеров, получаемых в ходе эксперимента, в основном определяются конкретными условиями отбора. В частности, условия отбора влияют на аффинность, специфичность и вторичную структуру аптамеров, определяют зависимость связывания аптамеров от присутствия в растворе различных ионов и других низкомолекулярных соединений и др. Таким образом, изменяя структуру библиотеки олигонуклеотидов, условия инкубации библиотеки с белком- мишенью и метод разделения связанных и несвязанных олигонуклеотидов, можно получать аптамеры с заданными свойствами.
