Механизм работы активного центра бактериальной РНК-полимеразы
Имеющиеся структурные и биохимические данные позволяют предположить следующий общий механизм работы активного центра РНК- полимеразы (РНКП) в процессе присоединения нуклеотидов ( Рис. 4.3 ) ( Landick, 2005 ). Связывание нуклеотида происходит в пост-транслокационном состоянии элонгационного комплекса (ЭК) , когда 3'-конец транскрипта находится в i-сайте активного центра . Активный центр при этом находится в "открытой" конформации, в которой возможно связывание нуклеотида в i+1-сайте ( Рис. 4.3 ). Нуклеотиды поступают в активный центр через вторичный канал РНКП. Предполагается, что первоначальное связывание нуклеотида происходит в так называемом Е-сайте (ES, entry- site), при этом трифосфатная группа субстрата взаимодействует со ионом MgII в активном центре, а нуклеозидная часть обращена во вторичный канал и не связана с матричной цепью ДНК ( Westover et al., 2004 ). Вероятно, что ион MgII поступает в активный центр в комплексе с нуклеотидом ( Рис. 4.3 ). На следующей стадии нуклеотид попадает в преинсерционный сайт (PS, preinsertion site), в котором основание образует комплементарные связи с матричным нуклеотидом ДНК, при этом рибоза и трифосфатная группа находятся в неактивной конформации и не могут участвовать в реакции. Затем происходит переход нуклеотида в инсерционный сайт (IS, insertion site), в котором трифосфатная группа и рибозная часть занимают оптимальное положение для синтеза РНК. После этого происходит собственно реакция синтеза РНК, которая катализируется двумя ионами Mg2+, связанными в активном центре.
Поскольку ширина вторичного канала в самом узком месте составляет 12-15 A, через него может одновременно проходить не более одного нуклеозидтрифосфата.
Вероятно, этим объясняется то, что скорость элонгации у многосубъединичных РНКП значительно ниже, чем у односубъединичных РНК- и ДНК-полимераз: от 10 до 50 нуклеотидов в секунду по сравнению 300-1000 нуклеотидов в секунду у односубъединичных полимераз. При помощи компьютерного моделирования было показано, что скорость диффузии NTP через вторичный канал РНКП II дрожжей достаточна для того, чтобы поддерживать скорость элонгации на уровне 10-20 нуклеотидов в секунду, даже несмотря на отрицательный электростатический потенциал, возникающий рядом с активным центром за счет связывания NTP в Е-сайте ( Batada et al., 2004 ).
