Элонгационный комплекс бактериальной РНК-полимеразы

Трехмерная структура элонгационного комплекса (ЭК) РНКП (РНК- полимеразы) была расшифрована для бактериальной РНКП T. thermophilus (в совместной работе лаборатории И.Арцимович и лаборатории Д.Васильева, ( Vassylyev et al., 2007a )), а также для РНКП II S.cerevisiae (в работах лабораторий Р.Корнберга и П.Крамера ( Gnatt et al., 2001 ; Kettenberger et al., 2004 ; Westover et al., 2004 ). Общая архитектура ЭК очень сходна в случае бактериальной и дрожжевой РНКП, с сохранением всех ключевых ДНК- и РНК-белковых контактов.

Для анализа структуры элонгационного комплекса РНКП T. thermophilus была использована синтетическая ДНК/РНК матрица, содержащая передний дуплекс ДНК длиной 14 пн, РНК-ДНК гибрид длиной 9 нт и однонитевую РНК длиной 7 нт, что позволило установить точное положение соответствующих участков ДНК и РНК внутри РНКП ( Рис. 3.5 А). В элонгационном комплексе дуплекс ДНК спереди от активного центра помещается внутри главного канала между доменами clamp и jaw бета'- субъединицы и доменом бета2. Однонитевой 5'-участок РНК-транскрипта выходит из РНКП под доменом flap бета-субъединицы. РНК-ДНК гибрид помещается в глубине главного канала, между доменами clamp бета'- субъединицы и доменами бета1 и бета2 бета-субъединицы. 3'-конец РНК находится в пост-транслокационном состоянии в i-сайте в активном центре фермента, при этом i+1-сайт свободен для связывания входящего нуклеотида. РНК и ДНК полностью закрывают доступ нуклеотидам в активный центр РНКП со стороны главного канала. Вероятно, нуклеотиды попадают в активный центр через вторичный канал РНКП ( Рис. 3.5 А и Б).

Точное положение нематричной цепи ДНК в расплавленном участке, а также заднего дуплекса ДНК в элонгационном комплексе остается неизвестным. Молекулярное моделирование показывает, что нематричная цепь ДНК, вероятнее всего, располагается между доменами бета1 и бета2 бета- субъединицы, а дуплекс ДНК выходит из РНКП в задней части главного канала и, возможно, жестко не зафиксирован на поверхности РНКП ( Рис. 3.5 Б).

Связывание ДНК и РНК внутри главного канала РНКП сопровождается конформационными изменениями нескольких доменов фермента, которые приводят к плотному "обхватыванию" нуклеиновых кислот внутри РНКП. Сравнение структур кор-фермента и холофермента РНКП ( Vassylyev et al., 2002 ; Zhang et al., 1999 ) со структурой ЭК показывает, что при связывании нуклеиновых кислот происходит закрывание главного канала, за счет движения доменов clamp, flap, бета1 и бета2 (эти домены показаны зеленым на Рис. 3.5 А).

Наибольшей подвижностью из перечисленных доменов обладает домен clamp бета'-субъединицы, положение которого значительно различается в изученных транскрипционных комплексах ( Gnatt et al., 2001 ; Landick, 2001 ; Vassylyev et al., 2002 ; Vassylyev et al., 2007a ). Домен clamp соединяется с остальной молекулой РНКП пятью подвижными белковыми петлями, которые получили название switch-районов ( Рис. 3.6 ). Районы switch1, switch2 и switch3 непосредственно взаимодействуют с нуклеиновыми кислотами в элонгационном комплексе. Предполагается, что данные взаимодействия могут вызывать конформационные изменения switch- районов, ведущие к закрыванию clamp-домена ( Gnatt et al., 2001 ).

Анализ структуры элонгационного комплекса позволил выявить несколько ключевых структурных элементов РНКП, которые определяют границы расплавленной области ДНК и границы РНК-ДНК гибрида в составе комплекса ( Рис. 3.7 и Рис. 3.8 ). Поступающий в РНКП передний дуплекс ДНК контактирует с районом fork2 бета-субъединицы, который, вероятно, играет активную роль в его расплетании ( Рис. 3.8 А).

Передний край РНК-ДНК гибрида ограничен F-спиралью , которая контактирует с основанием +1 нуклеотида в матричной цепи ДНК ( Рис. 3.8 А). Районы fork2 бета-субъединицы и rudder бета'-субъединицы контактируют с задней частью РНК-ДНК гибрида ( Рис. 3.5 и Рис. 3.7 ). Анализ РНКП с делецией rudder показал, что данный элемент необходим для стабильного удержания РНК-ДНК гибрида в составе элонгационного комплекса ( Kuznedelov et al., 2002a ); можно предположить, что район fork2 играет аналогичную функцию. Разделение РНК и ДНК у задней границы гибрида обеспечивается элементом lid бета'-субъединицы ( Рис. 3.8 Б), который контактирует как с 5'-концевым нуклеотидом РНК в составе гибрида, так и с комплементарным ему основанием в матричной цепи ДНК ( Рис. 3.8 Б). В соответствии со структурными данными, удаление данного элемента нарушает разделение РНК и ДНК и может приводить к формированию протяженного РНК- ДНК гибрида в ходе транскрипции ( Naryshkina et al., 2006 ; Zenkin et al., 2006 ). Формирование протяженного гибрида происходит только в том случае, если в качестве матрицы для транскрипции служит однонитевая ДНК. На двунитевой ДНК разделение РНК-ДНК гибрида происходит даже в отсутствие lid-элемента, вероятно, благодаря закрыванию заднего дуплекса ДНК ( Naryshkina et al., 2006 ; Toulokhonov and Landick, 2006 ). Задний дуплекс ДНК, по-видимому, формируется в районе элемента zipper бета'-субъединицы ( Рис. 3.7 ), однако, экспериментальные данные, подтверждающие роль этого элемента в формировании дуплекса, пока отсутствуют.

Благодаря фиксированному расположению структурных элементов, ограничивающих передний и задний дуплекс ДНК и РНК-ДНК-гибрид, конфигурация транскрипционного "пузыря" (длина расплавленной области и ДНК-гибрида) остается строго постоянной при перемещении РНКП в течение всей элонгации транскрипции. В то же время, было обнаружено, что в определенных участках матрицы РНКП может прекращать синтез РНК и смещаться назад по матрице ДНК. Этот процесс получил название backtracking (англ., смещение назад); образующийся в результате смещения транскрипционный комплекс был назван " смещенным" комплексом ( Рис. 3.9 ) ( Komissarova and Kashlev, 1997b ; Komissarova and Kashlev, 1997c ).

При смещении общие параметры транскрипционного пузыря сохраняются; при этом 3'-конец РНК разрывает связь с матричной ДНК и выходит из активного центра через вторичный канал РНКП ( Рис. 3.7 ). Главную роль в разделении передней границы РНК-ДНК гибрида при смещении элонгационного комплекса, вероятно, играет F-спираль РНКП. Реактивация смещенных комплексов может происходить либо в результате обратного смещения РНКП вперед по матрице ДНК, либо в результате отщепления 3'- концевого фрагмента РНК в активном центре фермента.

Ссылки:

Все ссылки