РНК-полимераза (РНКП): общий механизм инициации транскрипции
Транскрипционный цикл состоит из трех стадий: инициации, элонгации и терминации синтеза РНК. Инициация - это наиболее сложная стадия транскрипции.
Как известно, инициация происходит в специфических участках ДНК - промоторах , - и сама состоит из нескольких стадий. У бактерий все стадии инициации осуществляются холоферментом РНКП , ксостоящим из кор-фермента (субъединичный состав альфа2бетабета'омега) и фактора инициации - сигма-субъединицы , которая диссоциирует при переходе к элонгации транскрипции. Сигма-субъединица играет центральную роль в узнавании промоторов, плавлении ДНК и последующем уходе РНК-полимеразы (РНКП) с промотора. В клетках обычно присутствует несколько разных сигма- субъединиц, но большинство промоторов узнается при участии одной, главной сигма-субъединицы (сигма70 у Escherichia coli , сигмаA у других бактерий). В составе сигма-субъединицы имеется четыре эволюционно- консервативных района, каждый из которых состоит из несколько подрайонов (1.1 и 1.2; 2.1, 2.2, 2.3, 2.4 и 2.5; 3.1 и 3.2; 4.1 и 4.2) ( Рис. 1.1 ) ( Gross et al., 1998 ).
Промоторы бактерий содержат несколько специфических элементов, необходимых для их узнавания ( Рис. 1.1 ) ( Gross et al., 1998 ). Наиболее консервативными являются -10 (TATAAT) и -35 (TTGACA) элементы, которые расположены на расстоянии примерно 10 и 35 нуклеотидов левее старта транскрипции и узнаются районами 2.3/2.4 и 4.2 сигма-субъединицы, соответственно. Расстояние между -10 и -35 элементами у большинства промоторов составляет 17-18 нт (нуклеотидов). Промоторы с бoльшим (19 нт) или меньшим (16 нт) расстоянием узнаются РНКП с меньшей эффективностью и часто требуют для своего узнавания участия дополнительных факторов ( Gross et al., 1998 ; Haugen et al., 2008a ).
Некоторые промоторы содержат дополнительный элемент - динуклеотид TG, - который расположен на один нуклеотид левее -10 элемента и узнается районом 2.5 сигма-субъединицы ( Barne et al., 1997 ). Такие промоторы получили название промоторов с удлиненной -10 областью, для их узнавания не требуется -35 элемента ( Kumar et al., 1993 ). Наконец, некоторые сильные промоторы, в частности, промоторы рибосомальных РНК, содержат A/Т-богатую последовательность, расположенную на расстоянии 50-70 нт левее стартовой точки транскрипции, и получившую название UP-элемент ( Gourse et al., 1998 ). UP-элемент промоторов узнается С-концевым доменом альфа-субъединицы РНКП ( Рис. 1.1 ) ( Ross et al., 1993 ).
Еще одним элементом, который влияет на эффективность узнавания некоторых промоторов, является участок ДНК между -10 элементом и стартовой точкой транскрипции, который получил название дискриминатора ( Travers, 1980 ). Наличие G/C-богатого дискриминатора уменьшает стабильность промоторных комплексов и эффективность инициации транскрипции РНКП E. coli ( Gourse et al., 1998 ). Точная роль дискриминатора в узнавании промоторов до последнего времени оставалась неизвестной.
Было показано, что участок дискриминатора контактирует с районом 1.2 сигма70-субъединицы РНКП E. coli ( Haugen et al., 2006 ).
При взаимодействии РНКП с промотором сначала образуется "закрытый" промоторный комплекс , в котором ДНК находится в двунитевом состоянии. В процессе изомеризации комплекса, которая происходит в несколько стадий, РНКП осуществляет плавление цепей ДНК в районе стартовой точки транскрипции (от -11 до +2 нт), что приводит к формированию "открытого" промоторного комплекса ( Artsimovitch et al., 2004 ; deHaseth et al., 1998 ; Gross et al., 1998 ; Murakami et al., 2002a ; Ross and Gourse, 2005 ).
В плавлении ДНК важную роль играют взаимодействия района 2 сигма-субъединицы с -10 элементом промотора в составе нематричной цепи ДНК, которые сохраняются и после образования открытого комплекса ( Roberts and Roberts, 1996 ).
После образования открытого промоторного комплекса РНКП приступает к синтезу РНК. В отличие от ДНК-полимераз, инициация синтеза РНК РНКП не требует наличия затравки. Процесс инициации сопровождается синтезом коротких РНК-транскриптов (длиной от 2 до 9 нт, на некоторых промоторах до 15 нт), которые диссоциируют из транскрипционного комплекса. Данный процесс получил название абортивной инициации ( Gross et al., 1998 ; McClure, 1985 ). РНКП в ходе абортивной инициации остается связанной с промотором. Когда длина синтезированного РНК-транскрипта достигает 10-15 нт, происходит разрыв контактов РНКП с промотором и переход к элонгации, который сопровождается диссоциацией сигма-субъединицы. Синтез РНК на стадии элонгация осуществляется кор-ферментом РНКП . Было показано, что в некоторых случаях сигма остается связанной с РНКП в элонгационном комплексе, что может иметь регуляторное значение ( Bar-Nahum and Nudler, 2001 ; Mukhopadhyay et al., 2001 ). Как было установлено, сигма в составе элонгационного комплекса способна узнавать специфические последовательности в нематричной цепи ДНК, гомологичные -10 элементу промотора, что приводит к паузам транскрипции ( Ring et al., 1996 ; Roberts et al., 1998 ).
Исследования, проведенные в самые последние годы, значительно увеличили объем наших знаний о механизмах инициации транскрипции. Наибольший прогресс был достигнут в структурных исследованиях РНКП. В частности, были расшифрованы структуры сигма-субъединицы РНКП E. coli и T. aquaticus ( Campbell et al., 2002 ; Malhotra et al., 1996 ), кор-фермента РНКП T. aquaticus ( Zhang et al., 1999 ), холоферментов РНКП T. aquaticus и T. thermophilus ( Murakami et al., 2002a ; Murakami et al., 2002b ; Vassylyev et al., 2002 ), РНКП II дрожжей S.cerevisiae ( Cramer et al., 2001 ), элонгационного комплекса РНКП T. thermophilus и S. cerevisiae ( Gnatt et al., 2001 ; Vassylyev et al., 2007a ; Vassylyev et al., 2007b ), а также структуры комплексов РНКП с ингибиторами: миксопиронином ( Belogurov et al., 2008 ; Mukhopadhyay et al., 2008 ), стрептолидигином ( Temiakov et al., 2005 ; Tuske et al., 2005 ), альфа-аманитином ( Brueckner and Cramer, 2008 ; Bushnell et al., 2002 ), тагетитоксином ( Vassylyev et al., 2005 ), рифампицином ( Artsimovitch et al., 2005 ; Campbell et al., 2001 ), сорангицином ( Campbell et al., 2005 ). Кроме того, были расшифрованы структуры целого ряда транскрипционных факторов, непосредственно регулирующих работу активного центра РНКП: Gre-факторов ( Vassylyeva et al., 2007 ), белков DksA ( Perederina et al., 2004 ), Gfh1 ( Lamour et al., 2006 ; Laptenko et al., 2006 ; Symersky et al., 2006 ), Rnk ( Lamour et al., 2008 ). Анализ полученной информации позволил создать модели транскрипционных комплексов на разных стадиях синтеза РНК, понять основные принципы функционирования активного центра РНКП и регуляции активности РНКП.
Данный обзор посвящен анализу известных на сегодняшний день данных о структуре бактериальной РНКП и транскрипционных комплексов, механизмах работы активного центра РНКП и механизмах регуляции активности РНКП транскрипционными факторами, малыми молекулами и антибиотиками.
