Gre-факторы: структура и функции, стимуляция расщепления РНК
Популяция элонгационных комплексов (ЭК) РНК-полимеразы (РНКП), возникающих на одном и том же промоторе, неоднородна. Некоторая часть ЭК приостанавливает синтез РНК и находится в состоянии "паузы". Это может происходить из-за особенностей структуры матрицы, отсутствия комплементарного нуклеотида или в результате действия регуляторных факторов. Структура большей части паузирующих комплексов не нарушена и по прошествии некоторого времени (которое может составлять десятки секунд и более) они продолжают синтез РНК. В то же время, часть паузирующих комплексов может переходить в так называемое арестованное (arrested) состояние, в котором они не способны продолжить синтез РНК. По всей видимости, одной из основных причин образования арестованных элонгационных комплексов является смещение РНКП назад по матрице ДНК - backtracking , - в результате чего активный центр теряет контакт с 3'-концом новосинтезированной РНК (см. " Элонгационный комплекс РНК-полимеразы ) ( Komissarova and Kashlev, 1997a ; Komissarova and Kashlev, 1997c ; Krummel and Chamberlin, 1992 ; Nudler et al., 1997 ).
Реактивация арестованных смещенных ЭК происходит при отщеплении 3'-конца РНК-транскрипта, вытесненного во вторичный канал , в результате чего в активном центре РНКП вновь оказывается 3'-концевой рибонуклеотид, комплементарно связанный с ДНК-матрицей ( Kulish et al., 2000 ; Nudler, 1999 ). Важно отметить, что одним из факторов, стимулирующих образование смещенных ЭК, вероятно, является встраивание некомплементарного нуклеотида в 3'-конец синтезируемой РНК. В таком случае, смещение ЭК может являться механизмом, обеспечивающим исправление ошибок, происходящих в ходе транскрипции (proof-reading).
Хотя эндонуклеазное разрезание транскрипта осуществляется в активном центре самой РНКП, скорость этой реакции в отсутствие специальных белковых факторов очень низка. У E. coli имеется 2 фактора, которые способствуют разрезанию транскрипта - белки GreA и GreB ( Borukhov et al., 1992 ; Borukhov et al., 1993 ). Оба белка имеют молекулярную массу около 19 кДа и гомологичны по аминокислотной последовательности ( Borukhov et al., 1993 ). Гомологи Gre-факторов были обнаружены у большинства видов бактерий (в частности, у T. aquaticus и T. thermophilus ), что свидетельствует о важности катализируемой ими реакции ( Kulish et al., 2000 ). Как было показано, роль данных факторов заключается в стимуляции связывания каталитических ионов магния в активном центре РНКП ( Laptenko et al., 2003 ; Opalka et al., 2003 ; Sosunova et al., 2003 ).
Согласно данным рентгеноструктурного анализа, белки GreA и GreB состоят из двух примерно равных по размерам доменов, соединенных между собой гибкой междоменной петлей ( Рис. 5.1 ) ( Stebbins et al., 1995 ; Vassylyeva et al., 2007 ). N-концевой домен белка (остатки 1-80) представляет собой вытянутую coiled-coil структуру из двух антипараллельных альфа-спиралей. С-концевой домен белка является глобулярным, и состоит из альфа-спирали и бета-листа (бета-sheet), образованного пятью слоями ( Stebbins et al., 1995 ). Ни один из доменов по отдельности не способен стимулировать реакцию разрезания транскрипта ( Koulich et al., 1998 ). Моделирование комплекса РНКП с Gre-факторами, проведенное на основе имеющихся биохимических данных, показало, что связывание Gre-факторов, вероятно, происходит внутри вторичного канала РНКП, при этом глобулярный С-концевой домен располагается у входа во вторичный канал, а альфа-спиральный N-концевой домен проникает вглубь канала и направлен в сторону активного центра РНКП ( Laptenko et al., 2003 ; Opalka et al., 2003 ; Polyakov et al., 1998 ; Sosunova et al., 2003 ).
Проведенный рентгеноструктурный анализ кристаллов фактора GreB E. coli показал, что в кристаллической решетке внутренняя часть С- концевого домена одной из молекул белка взаимодействует с coiled-coil структурой N-концевого домена другой молекулы ( Vassylyeva et al., 2007 ). Coiled-coil cтруктура в составе Gre-факторов очень похожа на структуру бета'СС2-элемента бета'-субъединицы, ограничивающего одну из стенок вторичного канала РНКП. Это позволило предположить, что бета'СС2-элемент является основным сайтом связывания Gre-факторов во вторичном канале РНКП. Молекулярное моделирование позволило разместить молекулу GreB внутри вторичного канала таким образом, что С-концевой домен взаимодействует с бета'СС2-элементом, а протяженный N-концевой домен белка входит в просвет вторичного канала таким образом, что конец N- концевого домена находится в непосредственной близости от активного центра РНКП ( Рис. 5.2 А) ( Vassylyeva et al., 2007 ). Эта структура согласуется также со моделями комплексов РНКП с Gre-факторами, предполагаемыми на основании ряда биохимических данных ( Laptenko et al., 2003 ; Sosunova et al., 2003 ).
Два абсолютно консервативных аминокислотных остатка (Asp41 и Glu44 у E. coli), расположенных на конце N-концевого домена Gre-факторов, играют ключевую роль в реакции эндонуклеазного расщепления транскрипта ( Laptenko et al., 2003 ; Opalka et al., 2003 ; Sosunova et al., 2003 ; Vassylyeva et al., 2007 ). Моделирование структуры комплекса РНКП с GreB показывает, что эти отрицательно заряженные аминокислотные остатки участвуют в координации второго иона магния (MgII) в активном центре, необходимого для катализа реакции расщепления ( Рис. 5.2 Б). Данное предположение подтверждается тем, что замены данных аминокислотных остатков на незаряженные приводят к потере функциональной активности белка ( Laptenko et al., 2003 ; Opalka et al., 2003 ; Sosunova et al., 2003 ).
Следует сказать, что определенные мутации в активном центре РНКП значительно стимулируют реакцию расщепления и в отсутствие Gre-факторов. Так, замена консервативного остатка R1106 бета-субъединицы в РНКП E. coli (соответствует остатку R879 в РНКП T. thermophilus) на аланин увеличивает скорость расщепления РНК примерно на три порядка ( Sosunov et al., 2003 ). По-видимому, замена этого остатка вызывает изменение положения взаимодействующего с ним остатка D814 бета- субъединицы (соответствует D686 у T. thermophilus), который в результате становится способен координировать второй ион магния в активном центре ( Рис. 4.2 и Рис. 4.5 ). Можно предположить, что изменение позиции остатков R1106 и D814 может являться одним из механизмов регуляции различных активностей РНКП транскрипционными факторами.
Так как Gre-факторы взаимодействуют со смещенными элонгационными комплексами (ЭК) , описанный выше механизм взаимодействия предполагает, что GreA/B и 3'-конец новосинтезированной РНК могут находиться во вторичном канале одновременно. Действительно, на одной из сторон N-концевого домена белков GreA/B находится кластер положительно заряженных аминокислот. По-видимому, именно этой частью N-концевой домен Gre-белков взаимодействует с РНК, находящейся во вторичном канале в смещенном ЭК ( Kulish et al., 2000 ; Sosunova et al., 2003 ; Vassylyeva et al., 2007 ).
Функциональные активности GreA и GreB не совсем идентичны. GreA всегда индуцирует гидролиз моно-, ди- и тринуклеотидных фрагментов от 3'-конца РНК, в то время как GreB индуцирует отщепление фрагментов длиной от 2 до 18 нт, в зависимости от функционального состояния ЭК. Это коррелирует с наличием у GreB большего положительно заряженного региона, локализованного в структуре coiled-coil N-концевого домена ( Kulish et al., 2000 ; Stebbins et al., 1995 ). Взаимодействия Gre-белков с РНК, вытесненной во вторичный канал, вероятно, стабилизируют связывание Gre-белков с ЭК. Можно предположить, что эти взаимодействия обеспечивают специфичность действия Gre-белков in vivo, за счет стимуляции их связывания именно со смещенными ЭК.
Еще одной возможной, но пока недостаточно изученной функцией Gre- факторов in vivo, вероятно, является активация перехода от инициации к элонгации транскрипции. Экспериментально показано, что Gre-белки значительно повышают эффективность ухода РНКП с промотора и снижают уровень абортивной инициации ( Hsu et al., 1995 ; Sen et al., 2001 ). Хотя точный механизм этого процесса пока остается невыясненным, можно предположить, что связывание Gre внутри вторичного канала в ходе инициации может каким-то образом стабилизировать 3'-конец коротких РНК- транскриптов в активном центре РНКП, препятствуя их диссоциации из инициаторного комплекса.
