Реакции, катализируемые бактериальной РНК-полимеразой
РНК-полимераза (РНКП) - мультифункциональный фермент, который способен катализировать пять различных реакций ( Рис. 4.1 ) ( Sosunov et al., 2003 ):
1) Полимеризацию цепи РНК на матрице ДНК, то есть, реакцию присоединения нуклеотидов. Эта реакция происходит в пост- транслокационном состоянии элонгационного комплекса, когда 3'-конец РНК находится в i-сайте активного центра ( Рис. 4.1 А).
2) Экзопирофосфоролиз - реакцию, обратную синтезу РНК, т.е. перенос нуклеозидмонофосфата с 3'-конца новосинтезированной РНК на пирофосфат, в результате чего образуется НТФ ( Рис. 4.1 Б) ( Rozovskaya et al., 1982 ; Rozovskaya et al., 1984 ).
3) Экзонуклеазное расщепление синтезируемого РНК-транскрипта. Эта реакция аналогична предыдущей с той разницей, что в качестве акцептора нуклеозидмонофосфата в ней выступает вода ( Wang and Hawley, 1993 ). Обе реакции происходят в пре-транслокационном состоянии элонгационного комплекса, когда 3'-конец РНК находится в i+1-сайте активного центра ( Рис. 4.1 Б и В). Было обнаружено, что реакция экзонуклеазного расщепления значительно активируется нуклеотидами, некомплементарными следующему положению матрицы ( Рис. 4.2 Б) ( Sosunov et al., 2003 ). Предполагается, что связывание некомплементарного нуклеотида в этом случае происходит в так называемом Е-сайте, который является также сайтом предварительного связывания субстратов по пути к активному центру фермента.
4) Эндопирофосфоролиз - расщепление новосинтезированной РНК на расстоянии более одного нуклеотида от 3'-конца; при этом происходит перенос 3'-концевого олигонуклеотида РНК на пирофосфат ( Rudd et al., 1994 ). Такая реакция может происходить только в смещенных элонгационных комплексах , содержащих в активном центре внутреннюю часть РНК-транскрипта.
5) Реакцию эндонуклеазного расщепления синтезируемого РНК- транскрипта. Данная реакция аналогична предыдущей, но с заменой пирофосфата на воду ( Orlova et al., 1995 ). По-видимому, данная реакция имеет важное физиологическое значение и необходима для реактивации смещенных элонгационных комплексов ( Рис. 3.9 ). Хотя в физиологических условиях эта реакция катализируется РНКП с достаточно низкой эффективностью, было обнаружено, что скорость реакции значительно увеличивается при повышении рН среды ( Orlova et al., 1995 ), а также в присутствии специализированных факторов транскрипции ( Gre-факторов ).
Все перечисленные реакции, вероятно, происходят по сходному химическому механизму. Во всех пяти случаях РНКП катализирует перенос нуклеозидмонофофата (либо самого по себе, либо связанного с другими нуклеотидами РНК) с молекулы-донора на молекулу-акцептор. Эта реакция происходит по SN2-механизму, в ее катализе участвуют два иона Mg2+, координированные в активном центре РНКП ( Рис. 4.2 ) ( Sosunov et al., 2003 ; Steitz, 1998 ). В реакции синтеза первый из ионов (MgI) принимает участие в координировании атакующего 3'-концевого гидроксила РНК и атакуемой альфа-фосфатной группы NTP-субстрата, а второй (MgII) координирует альфа-фосфатную группу и уходящую пирофосфатную группировку ( Рис. 4.2 А). Реакция пирофосфоролиза происходит по обратному механизму, при этом ион MgII координирует атакующую пирофосфатную группировку и атакуемую фосфатную группу фосфодиэфирной связи, а MgI координирует фосфатную группу и уходящий 3'- концевой гидроксил ( Рис. 4.2 А). В реакции нуклеазного расщепления РНК в качестве атакующей группы выступает гидроксильная группа воды ( Рис. 4.2 Б).
Первый ион Mg2+ (MgI) в активном центре прочно связан с тремя абсолютно консервативными для всех РНКП остатками аспарагиновой кислоты консервативного мотива NADFDGD бета'-субъединицы (D460, D462, D464 у E. coli) ( Zaychikov et al., 1996 ).
Второй ион магния (MgII) связывается РНКП гораздо слабее ( Cramer et al., 2001 ; Sosunov et al., 2003 ; Vassylyev et al., 2002 ). Предполагается, что в связывании MgII принимают участие один или два из аспартатов мотива NADFDGD (D460 или D460 и D462), а также расположенный рядом консервативный аспартат бета-субъединицы РНКП (D814 у РНКП E. coli) ( Рис. 4.2 А) ( Artsimovitch et al., 2004 ; Sosunov et al., 2003 ; Sosunov et al., 2005 ; Vassylyev et al., 2007a ). Кроме того, в координации второго иона Mg2+, по-видимому, принимают участие субстраты реакций, катализируемых РНКП, и некоторые транскрипционные факторы. Так, в случае реакции синтеза РНК MgII координируется пирофосфатной группой входящего нуклеотида ( Рис. 4.2 А), в реакции пирофосфоролиза - пирофосфатом, в реакции экзонуклеазного расщепления - пирофосфатной группировкой некомплементарного нуклеотида ( Рис. 4.2 Б), а в реакции эндонуклеазного расщепления РНК - вспомогательными транскрипционными факторами ( Sosunov et al., 2003 ).
По всей видимости, нестабильность связывания каталитических ионов Mg2+ и своеобразная "недостаточность" активного центра РНКП обеспечивают универсальность катализируемых РНКП реакций. Именно благодаря ей вспомогательные факторы, будь то субстраты реакции или белковые регуляторы, оказываются способными напрямую регулировать каталитические активности РНКП.
