Gfh1-Белок
Поиск гомологов Gre-белков E. coli в геноме T. thermophilus позволил выявить два гена, гомологичных гену GreA ( Hogan et al., 2002 ; Лаптенко et al., 2000 ). Белковые продукты этих генов были впервые выделены и частично охарактеризованы в работе ( Лаптенко et al., 2000 ). Первый из них ( GreA ) стимулировал расщепление транскрипта в составе элонгационного комплекса (ЭК) , т.е. проявлял типичные для семейства Gre- белков свойства. Второй белок - Gfh1, от англ. Gre factor homolog 1 - обладал в несколько раз большей аффинностью к РНК-полимеразе (РНКП) и, к удивлению авторов, ингибировал расщепление транскрипта, равно как и элонгацию РНК в опытах по транскрипции in vitro ( Hogan et al., 2002 ; Лаптенко et al., 2000 ).
Было установлено, что Gfh1 в разной мере ингибирует все каталитические активности РНКП ( Laptenko et al., 2006 ; Symersky et al., 2006 ). Самый выраженный эффект Gfh1 оказывает на реакции синтеза РНК-транскрипта и пирофосфоролиза (50-кратное ингибирование); действие Gfh1 на экзо- и эндонуклеазное расщепление РНК менее выражено (от 10- до 2-кратного ингибирования в разных условиях ( Laptenko et al., 2006 ; Symersky et al., 2006 )). Кроме этого, как было показано, Gfh1 конкурирует с Gre-белками за связывание с РНКП, а так как Gre-белки осуществляют реактивацию арестованных элонгационных комплексов и способствуют переходу от инициации к элонгации транскрипции, данная конкуренция может оказывать дополнительный ингибирующий эффект на транскрипцию в целом.
В 2006 году структуры белка Gfh1 из T. thermophilus и его гомолога из T. aquaticus были расшифрованы тремя независимыми группами исследователей ( Lamour et al., 2006 ; Laptenko et al., 2006 ; Symersky et al., 2006 ), причем сходство полученных структур было очень высоким. Как и следовало ожидать, структура данного транскрипционного фактора очень похожа на структуру Gre-белков ( Рис. 5.3 ). На основе этого, по аналогии с Gre-факторами, авторами всех трех работ был сделан вывод о механизме действия Gfh1 - путем прямой модификации структуры активного центра РНКП через вторичный канал .
Gfh1 имеет несколько структурных отличий от GreA и GreB , которые, по-видимому, являются существенными для его функции. Наиболее заметным из них является иное взаимное расположение N- и С-концевого доменов: по сравнению с Gre-факторами, в Gfh1 С-концевой домен повернут на 172 градуса относительно N-концевого домена. Если принять, что практически идентичные по структуре С-концевые домены Gre и Gfh взаимодействуют с РНКП одинаковым образом, то N-концевой домен Gfh1 в данной конформации просто геометрически неспособен войти во вторичный канал. Поэтому было предположено, что эта конформация белка в кристалле является неактивной. При помощи методов белок-белковых сшивок было показано, что С-концевой домен Gfh1 может поворачиваться относительно N-концевого домена так, что конформация белка оказывается практически идентичной Gre ( Laptenko et al., 2006 ). Интересно, что Gfh1, в отличие от Grea и GreB, во всей видимости, "переключается" между активной и неактивной конформациями в зависимости от значения рН среды, причем "точка перехода" лежит в области физиологических значений рН (от 6,4 до 7,5). Так, при рН 7,5 и выше в активной форме находится только 5% белка Gfh1, а при рН 6,4 доля активных молекул составляет 90% ( Laptenko et al., 2006 ). Физиологическое значение данного регуляторного механизма пока не до конца ясно. В то же время, описанный случай представляет собой яркий пример участия вторичного канала РНКП в тонкой регуляции активности фермента и показывает, что РНКП способна дискриминировать активную и неактивную конформации транскрипционных факторов.
Сравнение аминокислотных последовательностей Gfh1 и Gre-факторов показывает, что наибольшее количество различий между ними сосредоточено в петле, соединяющей две альфа-спирали в дистальной части N-концевого домена и в прилегающих к ней участках ( Laptenko et al., 2006 ). Как было показано ранее, именно этот участок ответственен за стимуляцию связывания ионов магния в активном центре РНКП Gre-белками. У Gre-белков участок соединения двух альфа-спиралей в дистальной части N-концевого домена образован четырьмя аминокислотными остатками и имеет хорошо зафиксированную в пространстве структуру альфа-поворота (alpha-turn). У Gfh1 данный участок образован шестью аминокислотными остатками и формирует достаточно подвижную петлю. Кроме того, он содержит уже не два, а четыре консервативных остатка аспарагиновой кислоты; благодаря подвижной структуре концевой петли эти остатки могут сближаться в пространстве и образовывать отрицательно заряженные кластеры, чего у GreA и GreB происходить не может ( Symersky et al., 2006 ). Была выдвинута гипотеза, согласно которой Gfh1 ингибирует активность РНКП, координируя второй ион магния в активном центре (MgII) таким образом, что возможность последнего участвовать в катализе значительно снижается. Подтверждением этой гипотезы является тот факт, что Gfh1 ингибирует все различные активности РНКП в разной степени. Можно представить, что положение, в котором четыре аспартата Gfh1 фиксируют MgII, является более благоприятным для одной реакции и менее благоприятным для другой.
В работе ( Laptenko et al., 2006 ) было показано, что прилежащие к петле дистальные участки обеих альфа-спиралей N-концевого домена Gfh1 также важны для функционирования белка. Эти данные указывают на то, что в функционировании фактора важную роль играет не только структура петли N- концевого домена, но и еще некоторые пока не идентифицированные структуры внутри вторичного канала, с которыми могут взаимодействовать дистальные участки N-концевого домена.
