DksA-белок: стимуляция связывания ppGpp
Анализ действия ppGpp на активность РНК-полимеразы (РНКП) in vitro показал, что ингибиторный эффект ppGpp на транскрипцию оказывается в несколько раз слабее, чем in vivo. Это можно было бы объяснить существованием дополнительного фактора, усиливающего действие ppGpp in vivo. В результате генетических и биохимических исследований было установлено, что таким фактором является белок DksA ( Mallik et al., 2006 ; Paul et al., 2004a ; Paul et al., 2005 ; Perederina et al., 2004 ). Ген dksA был ранее охарактеризован как мультикопийный супрессор температурочувствительных мутаций в генах dnaK и dnaJ ( Kang and Craig, 1990 ). В экспериментах in vitro очищенный DksA снижает концентрацию ppGpp, необходимую для проявления ингибиторного эффекта, до величин, соответствующих физиологическим ( Paul et al., 2004a ).
Молекулярная структура DksA, расшифрованная в результате совместной работы лабораторий И. Арцимович и Д. Васильева ( Рис. 5.7 А), оказалась поразительно схожей со структурой Gre-белков ( Perederina et al., 2004 ). Как и Gre-белки, DksA состоит из двух доменов: N-концевого coiled-coil домена и С-концевого глобулярного домена. Структура N-концевых доменов DksA и Gre-белков практически идентична ( Рис. 5.7 А). Это тем более удивительно, что по аминокислотной последовательности эти белки совершенно не гомологичны. Наиболее существенные отличия DksA от Gre-белков заключаются в том, что в С- концевом домене DksA присутствует дополнительная альфа-спираль, и структура данного домена стабилизирована ионом Zn2+, который хелатирован четырьмя остатками цистеина ( Рис. 5.7 А).
Сходство структур DksA и Gre-белков позволило сразу высказать предположение, что DksA, как и Gre-белки, связывается во вторичном канале РНКП ( Perederina et al., 2004 ). Как и у Gre-белков, на конце N-концевого домена DksA, в участке петли, соединяющей две альфа-спирали, находятся два высококонсервативных отрицательно заряженных остатка аспарагиновой кислоты. Это позволило предполагать, что DksA может участвовать в координации ионов Mg2+. В то же время, в отличие от Gre-белков, DksA не стимулирует реакции эндонуклеазного расщепления и не может реактивировать смещенные элонгационные комплексы . Вероятно, это объясняется тем, что остатки аспарагиновой кислоты в случае DksA направлены в другую сторону, чем в Gre-белках, и не способны координировать каталитический ион MgII в активном центре РНКП.
Данные структурного моделирования позволяют предположить, что DksA необходим для стабилизации связывания ppGpp с РНКП через дистальный ион pMg2, который одновременно координируется отрицательно заряженными группами ppGpp и DksA ( Рис. 5.7 В) ( Perederina et al., 2004 ). Таким образом, можно утверждать, что белок DksA усиливает эффект транскрипционного регулятора ppGpp, стабилизируя связывание последнего с РНКП.
