ppGpp (Гуанозинтетрафосфат): регуляция инициации транскрипции
В ответ на нехватку аминокислот в среде в бактериальной клетке происходит угнетение транскрипции одних генов (в том числе, генов рибосомальных и транспортных РНК) и активация транскрипции других (генов синтеза аминокислот и транспортных оперонов). Этот феномен получил название "строгого контроля" (stringent control, или stringent response) ( Gourse et al., 1998 ; Potrykus and Cashel, 2008 ; Wagner, 2002 ). В отличие от многих других регуляторных механизмов, "строгий контроль" опосредуется не белковыми транскрипционными факторами, которые связываются с ДНК или РНКП, а малой молекулой гуанозинтетрафосфата, ppGpp.
Молекула ppGpp образуется в клетке в ответ на аминокислотное голодание; ppGpp основном синтезируется связанным с рибосомой белком RelA в том случае, если A-сайт рибосомы занят не аминоацилированной тРНК ( Hogg et al., 2004 ). Связываясь с РНК-полимеразой (РНКП), ppGpp подавляет транскрипцию одних генов и стимулирует транскрипцию других ( Chatterji et al., 1998 ; Hogg et al., 2004 ; Jores and Wagner, 2003 ; Paul et al., 2004b ; Toulokhonov et al., 2001 ).
Наиболее важная мишень действия ppGpp - промоторы генов рибосомальных РНК. Транскрипция с этих промоторов является лимитирующей стадией в процессе синтеза рибосом в клетке. В стадии логарифмического роста бактерий транскрипция с рибосомальных промоторов (7 промоторов в клетках E. coli) составляет более половины всей транскрипции в клетке.
Промоторы генов рРНК обладают необычными кинетическими свойствами, которые отличают их от всех других промоторов. Промоторы рРНК обладают рядом структурных особенностей, благодаря которым образующиеся на них промоторные комплексы являются нестабильными. Инициация транскрипции на этих промоторах очень чувствительна к внутриклеточной концентрации двух молекул: гуанозинтетрафосфата ppGpp - негативного регулятора активности промотора и инициаторного NTP - позитивного регулятора активности промотора. Обе эти малые молекулы служат индикаторами обеспеченности бактериальной клетки пищевыми субстратами ( Paul et al., 2004b ). Увеличение концентрации инициаторных нуклеотидов (прежде всего, АТР) увеличивает стабильность промоторных комплексов и повышает вероятность инициации на промоторах рРНК. Напротив, связывание ppGpp с РНКП значительно сокращает время жизни открытого комплекса на промоторах рРНК.
Анализ структуры РНКП T. thermophilus в комплексе с ppGpp показал, что ppGpp связывается во вторичном канале РНКП рядом с активным центром ( Рис. 5.4 А) ( Artsimovitch et al., 2004 ). Было обнаружено, что в двух различных молекулах РНКП в составе одной кристаллической ячейки ppGpp располагается в двух противоположных ориентациях: в одной из них к активному центру РНКП обращен 3'-дифосфат ppGpp (так называемая 3'- ориентация), а в другой молекула ppGpp повернута на 180 градусов, и к активному центру обращен 5'-дифосфат молекулы (5'-ориентация) ( Рис. 5.4 Б). В обеих ориентациях каждый из дифосфатов ppGpp связывает по одному иону Mg2+ ( Рис. 5.5 ) ( Artsimovitch et al., 2004 ). Ближайший к активному центру (проксимальный) ион магния получил обозначение pMg1, а удаленный от активного центра (дистальный) ион - pMg2 ( Рис. 5.4 ). Было предположено, что обе ориентации ppGpp являются функционально-значимыми и могут оказывать противоположный эффект на транскрипцию. Связывание ppGpp в различных ориентациях, вероятно, может регулироваться дополнительными транскрипционными факторами, оказывающими стимулирующий или ингибирующий эффект на транскрипцию.
ppGpp в 5'-ориентации, по-видимому, способствует связыванию второго каталитического иона магния (MgII) в активном центре ( Рис. 5.5 А). В этой ориентации 5'-дифосфатная группа молекулы взаимодействует с остатком R879 бета-субъединицы РНКП T. thermophilus (соответствует остатку R1106 в РНКП E. coli) таким образом, что остаток D686 бета- субъединицы, взаимодействующий с R879, приближается к активному центру РНКП и способствует связыванию иона MgII, что может стимулировать каталитическую активность РНКП. Возможно, именно по такому механизму происходит стимуляция транскрипции ppGpp.
Связывание ppGpp в 3'-ориентации, вероятно, оказывает ингибирующий эффект на транскрипцию, в основе которого могут лежать несколько гипотетических механизмов ( Рис. 5.5 Б). Во первых, связывание ppGpp может ослаблять связывание второго каталитического иона магния MgII в активном центре. Проксимальный ион магния pMg1, в данной ориентации связанный с 3'-дифосфатами ppGpp, напрямую взаимодействует с остатком D739 из каталитической триады аспартатов бета'-субъединицы, что приводит к изменению положения D739 и, вероятно, к потере иона MgII ( Рис. 5.5 Б). Кроме того, 3'-дифосфатная группа ppGpp изменяет положение остатка R879 бета-субъединицы таким образом, что взаимодействующий с ним остаток D686 бета-субъединицы также оказывается не способен участвовать в связывании иона MgII ( Рис. 5.5 Б).
Во-вторых, ppGpp в 3'-ориентации может влиять на связывание инициаторного нуклеотида в активном центре РНКП. Моделирование положения ppGpp в промоторном комплексе показывает, что ppGpp взаимодействует с остатками N737 и R879 бета'-субъединицы ( Рис. 5.6 ). Первый из этих остатков взаимодействует с рибозой, а второй - с трифосфатом входящего NTP ( Artsimovitch et al., 2004 ). Изменение положения данных остатков при взаимодействии с ppGpp может приводить к нарушению связывания NTP.
В-третьих, ppGpp в 3'-ориентации может взаимодействовать с нематричной цепью ДНК в расплавленном участке. Моделирование положения нематричной цепи ДНК в инициаторном комплексе показывает, что ppGpp в 3'-ориентации может образовывать комплементарные взаимодействия с нуклеотидами нематричной цепи в -1 и -2 положениях относительно старта транскрипции. Участок дискриминатора в рибосомальных промоторах содержит в -1 и -2 положениях остатки цитозина ( Travers, 1980 ), способные спариваться с гуанином ppGpp. Данные взаимодействия могут изменять положение нематричной цепи ДНК и напрямую приводить к дестабилизации промоторных комплексов ( Artsimovitch et al., 2004 ). Стоит отметить, что ppGpp также способен оказывать эффект на элонгацию транскрипции, вызывая паузы в определенных положениях матрицы. Картирование мест пауз показало, что они соответствуют положениям в ДНК, содержащим цитозины в нематричной цепи. Эти данные подтверждают, что ppGpp способен напрямую взаимодействовать с нематричной цепью ДНК на разных стадиях транскрипции.
