Транслокация бактериальной РНК-полимеразы и функция F-спирали
Механизм транслокации РНК-полимеразы (РНКП) и функция F-спирали.
Транслокация элонгационного комплекса (ЭК) после присоединения нуклеотида, по-видимому, происходит в две стадии ( Рис. 4.7 ). Сравнение структур ЭК бактериальной и эукариотических РНКП на различных стадиях каталитического цикла позволило предположить следующий механизм транслокации ( Brueckner and Cramer, 2008 ). Главную роль в транслокации играет F-спираль РНКП; структура центрального участка данной спирали в области активного центра , по-видимому, изменяется в процессе катализа. Непосредственно после присоединения нуклеотида F-спираль выпрямлена и имеет полностью альфа-спиральную структуру ( Рис. 4.7 А) ( Gnatt et al., 2001 ). Первая стадия транслокации заключается в перемещении 3'-конца РНК-ДНК гибрида из i+1 в i-сайт активного центра ( Рис. 4.7 Б).
При этом сначала происходит выпетливание центральной части F-спирали в сторону 3'-концевого нуклеотида РНК, причем остатки Thr1088 и Ala1089 (нумерация T. thermophilus) непосредственно взаимодействуют с основанием нуклеотида ( Рис. 4.7 Б). Данная структура наблюдается в ЭК бактериальной РНКП ( Vassylyev et al., 2007a ). Затем центральная часть F-спирали сдвигается в обратную сторону и оказывается в смещенном состоянии относительно выпрямленной конформации ( Рис. 4.7 В, Рис. 4.8 ).
Данное состояние удается зафиксировать в комплексе РНКП II с альфа-аманитином ( Brueckner and Cramer, 2008 ). Cдвинутая конформация F- петли стабилизируется заклиненной конформацией G-петли . Первая стадия транслокации сопровождается перемещением переднего дуплекса ДНК на один нуклеотид в сторону активного центра РНКП и плавлением одной пары нуклеотидов в +2 положении матрицы. В то же время, сдвинутая F-спираль препятствует попаданию матричного нуклеотида ДНК в активный центр РНКП.
Основным событием второй стадии транслокации является переход матричного нуклеотида ДНК в i+1 сайт активного центра ( Рис. 4.7 Г и Рис. 4.8 ) ( Kettenberger et al., 2004 ). F-спираль при этом возвращается в полностью выпрямленную конформацию, что сопровождается высвобождением заклиненной G-петли и ее переходом в открытое состояние ( Рис. 4.8 ). Вторая стадия транслокации также сопровождается дополнительным изменением положения переднего дуплекса ДНК и изменением конформации фосфата между +1 и +2 нуклеотидами матрицы ДНК ( Рис. 4.8 ) ( Brueckner and Cramer, 2008 ). В результате второй стадии транслокации РНКП оказывается готова к присоединению следующего нуклеотида.
Важная функциональная роль F-спирали в транслокации подтверждается тем, что большинство исследованных мутаций в F-спирали и прилежащих участках G-петли значительно снижают каталитическую активность РНКП ( Brueckner and Cramer, 2008 ; Epshtein et al., 2002 ; Kaplan and Kornberg, 2008 ; Tan et al., 2008 ).
С учетом всех имеющихся на сегодняшний день экспериментальных данных, можно заключить, что каталитический цикл РНКП состоит из следующих стадий, показанных на Рис. 4.9 ( Brueckner and Cramer, 2008 ). В пост-транслокационном состоянии активный центр находится в открытой конформации (F-спираль выпрямлена, G-петля открыта). Связывание нуклеотида сопровождается закрыванием активного центра за счет сворачивания G-петли. Данная стадия в случае бактериальной РНКП блокируется стрептолидигином . После этого происходит катализ и высвобождение пирофосфатной группы из активного центра, которое должно сопровождаться открыванием G-петли. Все перечисленные стадии являются необратимыми. После этого происходит двухстадийная транслокация РНКП, которая сопровождается изменением структуры F-спирали и переходом G- петли через заклиненную конформацию. Данная стадия в случае РНКП II блокируется альфа-аманитином. Транслокация, вероятно, осуществляется за счет броуновского движения и является обратимой. Присоединение следующего нуклеотида в пост-транслокационном состоянии запускает следующий каталитический цикл.
