Общий метод получения аптамеров
Аптамеры - это синтетические однонитевые молекулы ДНК или РНК, специфически узнаваемые белком-мишенью и полученные путем отбора из комбинаторных библиотек олигонуклеотидов ( Gold et al., 1995 ).
РНК-полимераза (РНКП) в процессе транскрипционного цикла осуществляет различные типы взаимодействий с ДНК и РНК. Холофермент РНКП узнает специфические последовательности ДНК ( промоторы ), при этом промоторные комплексы могут обладать разным уровнем стабильности ( Gourse et al., 1998 ; Gross et al., 1998 ). Кор-фермент РНКП в процессе элонгации взаимодействует с ДНК-матрицей и РНК-транскриптом неспецифически, причем элонгационный комплек с обладает крайне высокой стабильностью из-за топологической замкнутости нуклеиновых кислот внутри комплекса ( Gnatt et al., 2001 ; Nudler et al., 1996 ; Vassylyev et al., 2007a ). В то же время, кор-фермент на стадии элонгации способен узнавать специфические сигналы пауз и терминации транскрипции ( Artsimovitch and Landick, 2000 ; Landick, 1997 ; Toulokhonov and Landick, 2003 ; Toulokhonov et al., 2007 ). И холофермент, и кор-фермент также способны с низкой аффинностью связывать неспецифические последовательности ДНК ( Chamberlin, 1976 ; deHaseth et al., 1978 ; Spassky et al., 1979 ). Сигма-субъединица РНКП не способна взаимодействовать с природными последовательностями ДНК и РНК ( Gross et al., 1998 ).
При отборе аптамеров была поставлена задача получить лиганды, способные образовывать специфические и стабильные комплексы с каждым из компонентов РНКП: кор-ферментом, сигма-субъединицей и холоферментом. В качестве мишеней для отбора были выбраны РНКП мезофильной бактерии E. coli и термофильной бактерии T. aquaticus . Данные РНКП являются удобными объектами для исследований, так как первая из них хорошо охарактеризована биохимическими и генетическими методами, а для второй известна трехмерная структура.
Для получения высокоаффинных и специфичных аптамеров применялся метод, схема которого показана на Рис. 1.1 .
