Промоторный комплекс у бактерий: перестройки в ходе инициации транскрипции
Структурные перестройки промоторного комплекса в ходе инициации транскрипции.
В процессе взаимодействия с промотором и образования открытого комплекса РНК-полимераза (РНКП) формирует несколько промежуточных комплексов, имеющих различную структуру. Детальный анализ кинетики взаимодействия РНКП E. coli c несколькими сильными модельными промоторами (лямбдаPR, T7A1, lacUV5) позволил охарактеризовать отдельные стадии формирования открытого промоторного комплекса ( Buc and McClure, 1985 ; Craig et al., 1998 ; Kovacic, 1987 ; Record et al., 1996 ; Saecker et al., 2002 ; Schickor et al., 1990 ). В результате была предложена следующая обобщенная схема образования открытого промоторного комплекса и инициации транскрипции ( deHaseth et al., 1998 ; Haugen et al., 2008a ):
R+P переходит обратимо в RPC переходит обратимо в RPI переходит обратимо в RPO переходит обратимо в RPITC переходит необратимо в EC.
В приведенной схеме буквами R и P обозначены РНКП и промотор, соответственно; RPC - закрытый комплекс (от RNA polymerase-Promoter Сlosed Сomplex); RPI - промежуточный комплекс (RNA polymerase-Promoter Intermediate Сomplex); RPO - открытый комплекс (RNA polymerase-Promoter Open Сomplex); RPITC - инициаторный комплекс (RNA polymerase-Promoter Initially Transcribing Complex), синтезирующий короткие абортивные РНК- продукты; EC - элонгационный комплекс (Elongation Complex). Комплексы RPС и RPI содержат полностью двунитевую ДНК; в комплексе RPO ДНК расплавлена в районе стартовой точки транскрипции.
РНКП E. coli образует на большинстве промоторов очень стабильные открытые комплексы, и образование RPO является практически необратимым, равновесие в приведенной выше схеме сдвинуто вправо. В то же время, было обнаружено, что существуют промоторы, на которых РНКП не образует классических открытых комплексов. Первым из исследованных промоторов такого типа оказался промотор оперона генов рибосомальных РНК ( Gourse et al., 1998 ). Помимо рибосомальных промоторов, существует еще несколько групп промоторов E. coli, на которых РНКП образует нестабильные комплексы: промоторы генов тРНК (например, tyrT), промоторы оперонов биосинтеза нуклеотидов (например, pyrBI) и некоторых аминокислот (например, hisR) ( Donahue and Turnbough, 1990 ; Figueroa-Bossi et al., 1998 ; Pemberton et al., 2000 ). Комплексы РНКП с этими промоторами находятся в быстром равновесии между закрытым и открытым состояниями.
Транскрипция с большинства из промоторов, на которых РНКП не образует стабильных открытых комплексов, подвержена "строгому контролю" (stringent response) in vivo: в неоптимальных условиях роста синтез РНК с этих промоторов оказывается значительно подавлен. Характерной чертой промоторов, с которыми РНКП образует нестабильные комплексы, является наличие каких-либо отличий от канонической структуры: несоответствие последовательностей -10 и -35 элементов консенсусу, неоптимальная длина спейсера между ними и наличие дискриминатора в районе между -10 элементом и стартовой точкой транскрипции ( Gourse et al., 1998 ; Haugen et al., 2008a ). Вероятно, отличия от консенсусной структуры обеспечивают более тонкую регуляцию транскрипции на данных промоторах.
Трехмерная структура промежуточных комплексов, формирующихся в ходе образования открытого промоторного комплекса при переходе к элонгации транскрипции, остается неизвестной. Однако, анализ структуры РНКП, моделей открытого промоторного комплекса и элонгационного комплекса, а также имеющиеся биохимические данные (в частности, данные футпринтинга промежуточных промоторных комплексов различными нуклеазами и химическими агентами ( Craig et al., 1998 ; Saecker et al., 2002 )) позволяют обозначить основные структурные особенности этих комплексов ( Рис. 3.2 ).
В закрытом промоторном комплексе ДНК взаимодействует с РНКП в участке от -55 до -5 позиций относительно стартовой точки транскрипции, причем одна из сторон двунитевой молекулы ДНК не взаимодействует с РНКП и доступна действию нуклеаз.
Район 1.1 сигма-субъединицы при этом располагается внутри главного канала РНКП ( Рис. 3.2 А). Образование промежуточного промоторного комплекса (RPI) сопровождается существенными конформационными перестройками РНКП. ДНК остается в двухцепочечном состоянии, однако, футпринт РНКП расширяется примерно до +20 позиции промотора. Вероятно, при образовании RPI передний дуплекс ДНК входит в главный канал РНКП, при этом район 1.1 сигма вытесняется из канала ( Рис. 3.2 Б) ( Haugen et al., 2008a ). Было показано, что именно изомеризация закрытого комплекса в промежуточный является лимитирующей стадией всего процесса образования открытого комплекса ( Craig et al., 1998 ; Saecker et al., 2002 ).
При образовании открытого комплекса происходит плавление ДНК, которое инициируется в области -10 элемента, по-видимому, в результате взаимодействия ароматических аминокислотных остатков в районе 2.3 сигма- субъединицы с аденином во втором положении -10 элемента ( Schroeder et al., 2007 ; Schroeder and deHaseth, 2005 ). Плавление распространяется в область стартовой точки транскрипции, при этом нематричная цепь ДНК в области -10-элемента образует сиквенс-специфические контакты с сигма-субъединицей , а матричная цепь направляется в активный центр фермента и оказывается замкнута в канале между сигма-субъединицей и кор-ферментом РНКП . Передний дуплекс ДНК поворачивается примерно на 90 градусов и помещается между доменами clamp и jaw бета'-субъединицы ( Рис. 3.2 В).
Моделирование структуры инициаторного комплекса (RPITC) показывает, что синтезируемый в ходе инициации РНК-транскрипт должен располагаться в том же участке главного канала , в котором располагается район 3.2 сигма-субъединицы в холоферменте РНКП ( Рис. 3.2 Г). Это позволяет предположить, что при удлинении РНК происходит вытеснение этого района из главного канала РНКП. Кроме того, по мере удлинения РНК передний дуплекс ДНК поступает внутрь фермента, а транскрибированная часть ДНК выпетливается из главного канала РНКП (т.н. scrunching) ( Kapanidis et al., 2006 ; Revyakin et al., 2006 ). Все это приводит к увеличению "напряженности" в транскрипционном комплексе. Результатом этого может являться либо диссоциация РНК, либо дальнейшее удлинение РНК и сброс напряжения за счет разрыва контактов с промотором. При достижении длины около 10 нт РНК-транскрипт достигает района 4 сигма- субъединицы, который взаимодействует с доменом flap бета-субъединицы и перекрывает канал выхода РНК. Дальнейшее удлинение РНК должно приводить к окончательной диссоциации сигма-субъединицы и образованию активного элонгационного комплекса ( Рис. 3.2 Д).
Следует отметить, что сигма сохраняет способность связываться с элонгационным комплексом в процессе синтеза РНК ( Bar-Nahum and Nudler, 2001 ; Brodolin et al., 2004 ; Mukhopadhyay et al., 2001 ), при этом взаимодействие, видимо, происходит между районом 2 сигма и бета'СС1-элементом домена clamp бета'- субъединицы. Связывание сигма с элонгационным комплексом может вызывать паузы в синтезе РНК, что имеет регуляторное значение ( Brodolin et al., 2004 ; Nickels et al., 2004 ; Ring et al., 1996 ).
