Структурные элементы РНКП, определяющие скорость синтеза РНК
Различия в скоростях катализа РНК-полимеразы (РНКП) T. aquaticus и D. radiodurans были использованы для поиска функционально-важных районов активного центра РНКП, определяющих разные каталитические свойства РНКП разных бактерий.
Проведенный анализ трехмерной структуры элонгационного комплекса РНКП T. thermophilus позволил предположить, какие структурные элементы фермента могут быть задействованы в синтезе РНК ( Рис. 7.3 и Рис. 7.4 ) ( Vassylyev et al., 2007a ; Vassylyev et al., 2007b ). Собственно реакция образования фосфодиэфирной связи катализируется двумя ионами магния, связанными в активном центре РНКП. Участок связывания ионов магния (NADFDGD-мотив бета'-субъединицы) абсолютно консервативен в РНКП всех организмов. В связывании нуклеотида в активном центре РНКП в ходе катализа главную роль играют участки G-петли и F-спирали бета'- субъединицы (показаны на Рис. 7.3 красным и зеленым, соответственно). Изменение структуры данных участков в ходе катализа приводит к формированию "закрытой" конформации активного центра, обеспечивающей правильную ориентацию нуклеотида ( Рис. 7.3 ). Мутации в G-петле и F- спирали приводят к значительному снижению скорости катализа ( Temiakov et al., 2005 ; Toulokhonov et al., 2007 ; Vassylyev et al., 2007b ). С G-петлей контактирует домен jaw бета'- субъединицы (его фрагмент показан на Рис. 7.3 синим цветом), который может влиять на конформационную подвижность G-петли. Делеция домена jaw в РНКП E. coli снижает скорость элонгации транскрипции данной РНКП ( Ederth et al., 2002 ). Рядом с G-петлей и F-спиралью располагается участок РНКП, образованный консервативным районом F бета'-субъединицы, причем центральный фрагмент данного участка, F-петля , контактирует с G- петлей в закрытой конформации ( Рис. 7.3 ). Функции F-петли в транскрипции ранее исследованы не были.
Было выдвинуто предположение, что разные скорости синтеза РНК РНКП T. aquaticus и D. radiodurans могут определяться различиями в структуре перечисленных выше элементов активного центра. Поскольку последовательности участков связывания магния и F-спирали идентичны у T. aquaticus и D. radiodurans, основной вклад в изменения скорости данных РНКП могут вносить различия в участках G-петли (4 аминокислотные замены), F-петли (9 замен) и jaw-домена (36 замен) бета'-субъединицы. Выравнивание последовательностей участков F-петли и G-петли различных РНКП приведено на Рис. 7.4 . Для анализа функциональной роли данных участков были получены химерные варианты РНКП T. aquaticus, в каждом из которых один из перечисленных участков был заменен на соответствующий участок D. radiodurans. Мозаичные гены бета'-субъединицы были получены методами сайт-направленного мутагенеза; мутантные РНКП были выделены из клеток-суперпродуцентов E. coli.
Все химерные варианты РНКП являются активными, обладают высокой термостабильностью и не отличаются от РНКП T. aquaticus на стадиях узнавания промоторов и инициации транскрипции. В то же время, измерения скорости присоединения нуклеотидов (при 20 градусах) выявили значительные различия между химерными РНКП ( Рис. 7.5 ). Установлено, что замена G-петли практически не оказывает влияния на скорость катализа. Замена домена jaw приводит к незначительному ускорению синтеза РНК (примерно в 2-3 раза, Рис. 7.5 ). Наибольший эффект оказывает замена F- петли, которая вызывает ускорение катализа РНКП T. aquaticus примерно в 50 раз ( Рис. 7.5 ). Скорость катализа этой химерной РНКП оказывается всего в 6 раз меньше, чем скорость катализа РНКП D. radiodurans в этих же условиях. Для дальнейшего анализа роли F-петли в катализе был получен мутантный вариант РНКП T. aquaticus с делецией центрального фрагмента F- петли. Выяснилось, что эта делеция приводит к снижению скорости синтеза РНК более чем в 100 раз ( Рис. 7.5 ).
Полученные данные показывают, что участок F-петли играет важнейшую роль в катализе присоединения нуклеотидов РНКП. Так как F-петля контактирует с G-петлей в закрытой конформации активного центра, можно предположить, что F-петля способствует правильному сворачиванию G-петли в процессе катализа.
Для проверки этого предположения исследовано действие стрептолидигина на активность РНКП. (Антибиотик стрептолидигин (Stl) блокирует правильное сворачивание G-петли ( Vassylyev et al., 2007b )).
Stl эффективно блокирует активность РНКП T. aquaticus дикого типа, снижая скорость присоединения нуклеотида примерно в 80 раз ( Рис. 7.6 ). Stl также подавляет активность РНКП с заменой F-петли, причем эффект антибиотика в данном случае оказывается даже сильнее (снижение скорости примерно в 3300 раз). В то же время, Stl практически не действует на РНКП с делецией F-петли (снижение скорости примерно в 2 раза) ( Рис. 7.6 ). Замечательно, что скорости всех трех РНКП в присутствии антибиотика оказываются примерно одинаковы. Контрольные эксперименты показали, что Stl связывается с РНКП с делецией F-петли примерно с такой же эффективностью, как с РНКП дикого типа. Таким образом, наиболее вероятным объяснением отсутствия эффекта Stl на активность РНКП с делецией F-петли является то, что стадия катализа, которая блокируется Stl в РНКП дикого типа (то есть, сворачивание G-петли), оказывается нарушена в мутантной РНКП и в отсутствие антибиотика.
В целом, полученные результаты свидетельствуют, что F-петля способствует образованию закрытой конформации активного центра РНКП в ходе катализа, за счет контактов с G-петлей ( Рис. 7.3 и Рис. 7.7 ). Замены неконсервативных аминокислотных остатков, различающихся в РНКП T. aquaticus и D. radiodurans, могут либо непосредственно влиять на контакты с G-петлей, либо изменять структуру и конформационную подвижность F-петли. Таким образом, скорость работы активного центра РНКП аллостерически регулируется элементами, не принимающими непосредственного участия в связывании нуклеотидов и в катализе образования фосфодиэфирной связи. Изменения в структуре данных участков приводят к значительным изменениям в скорости катализа, что обеспечивает адаптивные различия в активности РНКП разных бактерий.
