Роль сигма-субъединицы в уходе РНК-полимеразы с промотора
В процессе ухода с промотора при переходе к элонгации транскрипции РНК-полимераза (РНКП) должна разорвать специфические контакты с ДНК, образовавшиеся на стадии инициации. Эти контакты значительно затрудняют переход к элонгации, в результате чего возникает абортивная инициация - диссоциация коротких РНК-продуктов без отрыва РНКП от промотора ( Hsu, 2002 ; Hsu, 2009 ; McClure, 1985 ). Эффективность перехода к элонгации определяется при этом как соотношение эффективности синтеза полноразмерных и абортивных РНК-продуктов. До настоящего времени механизм абортивной инициации, а также механизмы структурных перестроек РНКП, происходящих при переходе к элонгации, оставались неизвестны.
Молекулярное моделирование, основанное на сравнении структур холофермента РНКП и элонгационного комплекса , показывает, что положение синтезируемого в ходе инициации РНК-транскрипта перекрывается с положением района 3.2 сигма-субъединицы в холоферменте РНКП (начиная с 5-го нуклеотида) ( Рис. 5.1 ). По-видимому, столкновение синтезируемой РНК с районом 3.2 сигма-субъединицы может приводить или к диссоциации РНК, или вытеснению сигма-субъединицы из главного канала РНКП. Возможно, первый из данных процессов является одной из причин абортивной инициации, а второй - способствует уходу РНКП с промотора и переходу к элонгации транскрипции ( Murakami and Darst, 2003 ; Murakami et al., 2002a ; Vassylyev et al., 2002 ; Young et al., 2002 ). Для проверки этой гипотезы был исследовн процесс перехода к элонгации РНКП E. coli, содержащей сигма70-субъединицу с делецией района 3.2 (дельта513-519). Для анализа синтеза абортивных продуктов различной длины был использован промотор T7A1cons, характеризующийся исключительно высокой эффективностью абортивного синтеза, что, вероятно, объясняется сильными специфическими взаимодействиями РНКП с консенсусными промоторными элементами (см. " Стабильность промоторных комплексов и переход к элонгации ").
Анализ РНК-продуктов, синтезируемых РНКП E. coli (дикого типа и с делецией дельта513-519 в районе сигма 3.2) в ходе транскрипции на промоторах Т7A1 и Т7A1cons, показал: мутантная РНКП синтезирует заметно меньшее количество и полноразмерных РНК-транскриптов и коротких абортивных продуктов (5-7 нт), чем РНКП дикого типа ( Рис. 5.2 А и Рис. 6.1 А). В то же время мутантная РНКП синтезирует на этом промоторе более длинные абортивные продукты (10-16 нт) с той же высокой эффективностью, как и РНКП дикого типа ( Рис. 5.2 А). Анализ соотношения абортивных транскриптов длиной 10-16 нт и полноразмерной РНК, синтезируемых на промоторе Т7A1cons, показывает, что это соотношение значительно выше у РНКП с делецией района сигма 3.2, чем у РНКП дикого типа ( Рис. 6.1 Б). Следовательно, у мутантной РНКП снижена эффективность перехода к элонгации транскрипции. Таким образом, район 3.2 играет важную роль в уходе РНКП с промотора. Полученные данные показывают, что район 3.2 сигма-субъединицы в РНКП дикого типа стимулирует диссоциацию коротких РНК-транскриптов (5-7 нт), по-видимому, за счет блокирования канала выхода РНК . Удаление района 3.2 в случае мутантной РНКП стабилизирует короткие РНК-продукты, но при этом приводит к увеличению синтеза длинных абортивных продуктов и к нарушению процесса ухода РНКП с промотора.
Чтобы выяснить, взаимодействует ли район 3.2 сигма-субъединицы с 5'-концом синтезируемой РНК в активном центре РНКП, провели эксперименты по образованию ковалентных сшивок РНКП с модифицированным аналогом 5'- инициаторного нуклеотида, содержащим реакционно-способную алкилирующую группу в 5'-положении ( Рис. 6.2 А, дор. 2). Установлено, что в случае РНКП дикого типа сигма образует сшивку с модифицированным нуклеотидом в ходе инициации транскрипции ( Рис. 6.2 Б, дор. 2). В то же время, такая сшивка не образуется в случае сигма с делецией района 3.2 ( Рис. 6.2 Б, дор. 3). Полученные данные показывают, что район 3.2 сигма находится в непосредственной близости от 5'-конца РНК-транскрипта в ходе инициации.
Итак, конкуренция синтезируемой РНК с районом 3.2 сигма в ходе инициации является необходимым условием для эффективного перехода к элонгации транскрипции. Стоит отметить, что на пути синтезируемого РНК- транскрипта в канале выхода РНК, кроме района 3.2, располагается район 4 сигма-субъединицы ( Рис. 2.1 ). Этот район сигма также препятствует переходу к элонгации транскрипции и должен диссоциировать от кор- фермента в процессе ухода с промотора. Конкуренция РНК с районом 4 сигма-субъединицы является одной из причин образования длинных абортивных РНК-продуктов (до 16 нт) ( Nickels et al., 2005 ). Делеция района 3.2 приводит к накоплению именно длинных абортивных транскриптов, что свидетельствует о нарушении процесса диссоциации района 4 сигма- субъединицы в ходе инициации. Таким образом, вытеснение района 3.2 из главного канала РНКП синтезируемой РНК на ранних стадиях инициации является необходимым условием для эффективного перехода к элонгации транскрипции, так как приводит к ослаблению контактов сигма-субъединицы с кор-ферментом РНКП. Это способствует дальнейшей диссоциации сигма- субъединицы и разрыву контактов РНКП с промотором в ходе инициации.
