Стабильность промоторных комплексов и переход к элонгации
Стабильность промоторных комплексов и эффективность перехода к элонгации.
Так как переход от инициации к элонгации транскрипции сопровождается разрывом контактов РНК-полимераза (РНКА) с промотором, эффективность ухода с промотора во многом определяется силой данных контактов ( McClure, 1985 ). Интенсивность абортивной инициации и эффективность ухода РНКП с промотора зависят от структуры промотора, однако, систематических исследований взаимосвязи между наличием в промоторе разных типов консенсусных элементов и эффективностью перехода к элонгации не проводилось ( Hsu, 2002 ; Hsu, 2009 ).
Усиление контактов РНКП с промотором при введении в его состав консенсусных элементов затрудняет переход к элонгации. Так на Т7A1cons- промоторе, содержащем консенсусные -10 и -35 элементы, РНКП E. coli синтезирует гораздо большее количество абортивных продуктов различной длины (и меньшее количество полноразмерной РНК), чем на T7A1-промоторе дикого типа с неконсенсусными элементами ( Рис. 6.4 , дор. 1 и 2). Аналогичное явление наблюдается при сравнении промоторов sTap2+35 и sTap2+35-GGGA (с и без GGGA-элемента, соответственно). На первом из промоторов, содержащем GGGA-элемент, РНКП E. coli синтезирует гораздо большее количество абортивных продуктов (по сравнению с полноразмерной РНК), чем на промоторе, не содержащем GGGA ( Рис. 3.3 В). Показано, что на промоторах, характеризующихся высокой эффективностью абортивного синтеза, РНКП E. coli образует гораздо более стабильные комплексы ( Рис. 4.8 ).
Анализ температурной зависимости синтеза абортивных и полноразмерных РНК-продуктов РНКП E. coli на lacUV5-промоторе показывает, что с повышением температуры эффективность перехода от инициации к элонгации транскрипции заметно снижается ( Рис. 6.3 ). Что сопровождается повышением стабильности промоторного комплекса. Таким образом, стабилизация комплексов РНКП с промотором, независимо от способа стабилизации, приводит к снижению эффективности ухода РНКП с промотора.
В случае РНКП T. aquaticus , как и в случае РНКП E. coli , введение в промотор консенсусных элементов также приводит к стимуляции абортивного синтеза ( Рис. 3.3 В и Рис. 6.4 ) и увеличению стабильности комплексов ( Рис. 4.8 ). В то же время обнаружено, что РНКП T. aquaticus характеризуется гораздо большей эффективностью перехода к элонгации на большинстве исследованных промоторов, чем РНКП E. coli. Об этом можно, в частности, судить по соотношению абортивных и полноразмерных РНК- продуктов, синтезируемых данными РНКП на промоторе Т7A1cons: в случае РНКП T. aquaticus образуется значительно меньшее количество абортивных продуктов и значительно большее количество полноразмерной РНК, чем в случае РНКП E. coli ( Рис. 6.4 ). РНКП D. radiodurans также обладает более высокой эффективностью перехода к элонгации, чем РНКП E. coli. Можно предположить, что это напрямую объясняется тем, что промоторные комплексы РНКП T. aquaticus и D. radiodurans гораздо менее стабильны, чем комплексы РНКП E. coli. При этом различия в стабильности промоторных комплексов РНКП E. coli, T. aquaticus и D. radiodurans определяются как сигма-субъединицей, так и кор-ферментом РНКП. Таким образом, эффективность ухода РНКП, вероятно, зависит не только от специфических контактов сигма с промоторными элементами, но и от неспецифических контактов кор-фермента с промоторной ДНК.
В целом, результаты проведенных экспериментов позволяют утверждать, что усиление контактов РНКП с промотором, за счет введения в него консенсусных элементов или изменения условий реакции, приводит к увеличению стабильности промоторного комплекса и, как следствие, к снижению эффективности перехода к элонгации. Аналогичная зависимость наблюдается при сравнении РНКП разных бактерий, образующих промоторные комплексы с разной стабильностью и различающихся по эффективности перехода к элонгации транскрипции.
