Switch2-район бета'-субъединицы: инициация синтеза РНК
Роль района switch2 бета'-субъединицы в инициации синтеза РНК.
Анализ трехмерной структуры холоферментов РНК-полимеразы (РНКП) T. aquaticus и T. thermophilus показывает, что район 3.2 сигма- субъединицы контактирует с участком switch2 бета'-субъединицы РНКП (аминокислоты 322-348 у E. coli), который, в свою очередь, располагается поблизости от матричной цепи ДНК ( Рис. 5.1 ). Контакты данного района с ДНК важны для стабилизации промоторного комплекса (см. " Стабилизация промоторного комплекса: контакты кор-фермента с ДНК "). Известно, что район switch2 в холоферменте имеет другую конформацию, чем в кор-ферменте РНКП ( Рис. 5.1 ) ( Vassylyev et al., 2002 ; Zhang et al., 1999 ). Это можно объяснить связыванием сигма-субъединицы и контактами switch2 с районом сигма3.2. По-видимому, сигма-субъединица влияет на структуру активного центра и связывание нуклеотидов вследствие изменения контактов района switch2 с матричной цепью ДНК, что может как непосредственно влиять на связывание субстратов, так и изменять конформацию других участков активного центра, задействованных в катализе (в частности, F-спирали , Рис. 5.1 ).
Для проверки этого предположения были исследованы транскрипционные свойства РНКП E. coli с мутациями остатка Arg339 в районе switch2. Этот остаток контактирует с фосфатом в +2 положении матричной цепи ДНК спереди от активного центра РНКП в элонгационном комплексе ( Vassylyev et al., 2007a ). И, вероятно, в промоторном комплексе РНКП (см. " Стабилизация промоторного комплекса: контакты кор-фермента с ДНК ") ( Рис. 5.1 ). Были получены мутантные варианты РНКП E. coli с заменами Arg399 на Glu, Ala и Lys. В экспериментах по транскрипции in vitro показано, что РНКП с заменами Arg399 на Glu и Ala не способны к эффективной инициации транскрипции в отсутствие затравки, в то время как РНКП с заменами на Lys, почти не отличается от РНКП дикого типа по эффективности синтеза РНК ( Рис. 5.4 , дор. 1-4). Наличие динуклеотидной затравки СрA значительно стимулирует активность РНКП с заменами Arg339 на Glu и Ala ( Рис. 5.4 , дор. 6 и 7). Таким образом, данные мутации, как и делеция района 3.2 сигма-субъединицы, нарушают образование первой фосфодиэфирной связи РНК. Что подтверждает роль района switch2 бета'- субъединицы в передаче аллостерического сигнала от сигма-субъединицы в активный центр РНКП.
Следует отметить, что на стадии элонгации транскрипции роль, аналогичную району 3.2 сигма-субъединицы, может выполнять РНК- транскрипт, который на расстоянии 5-8 нуклеотидов от 3'-конца располагается в том же месте, что и район 3.2 сигма в холоферменте РНКП. Вероятно, контакты синтезируемой РНК с районом switch2 могут вызывать аналогичные конформационные изменения в активном центре РНКП, необходимые для связывания нуклеотидных субстратов в процессе элонгации.
Данные о структуре РНКП II S.cerevisiae и комплексов РНКП II с ДНК и транскрипционными факторами позволяют предположить, что инициация синтеза РНК и, в частности, связывание инициаторных нуклеотидов в случае эукариотической РНКП происходит по аналогичному механизму ( Bushnell et al., 2004 ). Показано, что транскрипционный фактор TFIIB может выполнять в инициации синтеза РНК роль, аналогичную сигма- субъединице бактериальной РНКП ( Boeger et al., 2005 ; Bushnell et al., 2004 ; Pal et al., 2005 ). Белковая петля, образованная finger-подобным доменом данного фактора, располагается в непосредственной близости от активного центра РНКП II, в месте, соответствующем расположению района 3.2 сигма-субъединицы ( Bushnell et al., 2004 ). Мутации в данном районе фактора TFIIB влияют на связывание инициаторных нуклеотидов и синтез первых связей РНК ( Majovski et al., 2005 ; Tran and Gralla, 2008 ). Таким образом, механизм инициации синтеза РНК в активном центре РНКП, по-видимому, высококонсервативен у разных групп организмов.
