Общий механизм узнавания промоторов
Холофермент бактериальной РНК-полимеразы (РНКП) содержит единственный фактор инициации - сигма-субъединицу . Большинство клеточных промоторов узнается холоферментом РНКП, содержащим главную сигма- субъединицу (которая для краткости обычно называется просто сигма- субъединицей) ( сигма70 у E. coli или сигмаA у других бактерий).
В составе главных сигма-субъединиц выделяют четыре консервативных района, каждый из которых состоит из несколько подрайонов ( Рис. 2.1 ). Известно, что в узнавании -10, TG и -35 элементов промоторов принимают участие районы 2.3/2.4, 2.4/2.5 и 4.2 сигма-субъединицы, соответственно ( Gross et al., 1998 ; Sanderson et al., 2003 ; Schroeder et al., 2007 ).
После первоначального взаимодействия РНКП с промотором происходит плавление ДНК и образование открытого промоторного комплекса . В плавлении ДНК ведущую роль играют контакты района 2 сигма-субъединицы с -10 элементом промотора в нематричной цепи ДНК ( Gross et al., 1998 ; Roberts and Roberts, 1996 ). Как было установлено, -10 элемент промотора узнается сигма-субъединицей именно в составе нематричной цепи ДНК ( Roberts and Roberts, 1996 ). Контакты сигма-субъединицы с -10 элементом в расплавленном участке ДНК сохраняются в открытом промоторном комплексе и, вероятно, необходимы для поддержания его стабильности ( Gross et al., 1998 ). Стабильность промоторного комплекса является одной из его важнейших характеристик и во многом определяет эффективность транскрипции с данного промотора ( Gourse et al., 1998 ; Gross et al., 1998 ).
Анализ трехмерной структуры холофермента РНКП термофильных бактерий с использованием имеющихся биохимических данных, полученных при исследовании РНКП E. coli и других мезофильных бактерий, позволил создать структурную модель открытого промоторного комплекса ( Рис. 2.1 ) ( Artsimovitch et al., 2004 ; Murakami et al., 2002a ). Данная модель показывает примерное расположение цепей ДНК в промоторном комплексе и позволяет предположить, какие функции выполняют различные структурные элементы кор-фермента и сигма-субъединицы РНКП во взаимодействиях с ДНК и в инициации синтеза РНК. В то же время, точная трехмерная структура промоторного комплекса и детальный молекулярный механизм узнавания промоторных элементов, а также роль других участков промоторной ДНК в узнавании промоторов РНКП различных бактерий остаются неизвестны.
Несмотря на то, что сигма-субъединица играет ключевую роль в узнавании промоторов, в свободном виде она не взаимодействует с промоторами. Кор-фермент РНКП индуцирует определенные конформационные перестройки сигма-субъединицы, которые приводят к демаскированию ее ДНК- узнающих сайтов. Точные механизмы данных изменений во многом остаются неизвестны. В составе холофермента сигма-субъединица взаимодействует с бета- и бета'-субъединицами кор-фермента, причем общая площадь белок- белковых контактов достигает 8000 кв. ангстрем (A) и является одной из самых больших среди всех известных белок-белковых комплексов ( Murakami et al., 2002b ; Vassylyev et al., 2002 ). Показано, что наибольший вклад в связывание сигма70 с кор-ферментом E. coli вносят контакты с участком бета'СС1, образованным аминокислотными остатками 262-309 бета'-субъединицы и имеющим структуру двух альфа-спиралей ( Arthur and Burgess, 1998 ; Vassylyev et al., 2002 ) ( Рис. 4.5 ). Однако, неизвестно, играет ли взаимодействие сигма-субъединицы с данным участком какую-либо роль в стимуляции ее ДНК-узнающей активности.
