Получение аптамеров при подавлении доминирующего эпитопа мишени
Для подавления доминирующего эпитопа мишени и получения аптамеров к другим участкам белка (или к другим белкам в случае сложных мишеней) используют следующие методы.
1) При отборе используют библиотеки разной структуры. В нескольких экспериментах было показано, что использование РНК и ДНК библиотек может привести к получению аптамеров к различным эпитопам одной и той же мишени. Так, описано получение РНК- и ДНК-аптамеров к тромбину, которые связываются в разных участках молекулы и по-разному влияют на функциональные свойства тромбина ( Bock et al., 1992 ; Kubik et al., 1994 ).
2) Доминирующий сайт связывания нуклеиновых кислот можно экранировать различными полианионными конкурентами связывания нуклеиновых кислот: гепарином ( Thomas et al., 1997 ), poly(dA-dT), тРНК ( Allen et al., 1995 ), неамплифицируемой случайной библиотекой ( Jensen et al., 1995 ; Yamamoto et al., 2000b ) и др. В этом случае отбор либо может быть направлен к другому эпитопу мишени, либо привести к идентификации более аффинных аптамеров к прежнему сайту связывания.
3) Для экранирования доминирующего эпитопа можно использовать полученные ранее аптамеры, узнающие данный сайт белка ( Kumar et al., 1997 ).
4) Для того, чтобы исключить какой-либо эпитоп белка-мишени из отбора, можно использовать модифицированную форму белка, у которого отсутствует данный эпитоп.
5) Аналогичного результата можно достичь, используя процедуру контр-селекции (counter-selection), которая позволяет исключить из олигонуклеотидной библиотеки последовательности, специфичные для данного эпитопа. Эта процедура заключается в том, что в некоторых раундах проводится отбор последовательностей, которые не взаимодействуют с конкретным эпитопом белка-мишени. Так, при ненаправленном отборе аптамеров к Qбета-репликазе селектируются аптамеры, узнающие белок S1 . Направление отбора удается изменить, проводя контр-селекцию аптамеров против 30S-субчастицы рибосомы. При этом последовательности, узнающие белок S1, взаимодействуют с рибосомой и исключаются из дальнейшего отбора ( Brown and Gold, 1995 ).
6) Для удаления последовательностей доминирующего класса был предложен метод их направленной деградации при помощи РНКазы H. Для этого библиотеку инкубируют с короткими олигонуклеотидами (8-12 нт), комплементарными участку последовательности доминирующего класса аптамеров. В случае РНК-библиотеки используются ДНК-олигонуклеотиды, и наоборот. РНКаза Н специфически опознает и расщепляет участки РНК/ДНК гибрида, что приводит к уничтожению данного класса последовательностей ( Shi et al., 2002 ).
При отборе аптамеров к мишеням, состоящим из большого количества белков, перед проведением отбора можно удалить белок, содержащий доминирующий эпитоп.
Например, при отборе аптамеров к малой субчастице рибосомы для того, чтобы избежать отбора аптамеров к белку S1, в качестве мишени были использованы 30S-субчастицы, не содержащие данного белка ( Ringquist et al., 1995 ). Одним из способов удаления доминирующего белка из сложных мишеней, содержащих смесь многих белков, является связывание его на аффинной колонке с аптамером, специфичным к данному белку.
Использование обедненной мишени в последующем эксперименте по отбору позволяет идентифицировать новые классы аптамеров, специфичных к другим белкам. Последовательное применение данной процедуры может быть использовано для идентификации большого количества белков и анализа состава сложных мишеней ( Fitter and James, 2005 ).
