Регулируемые и сигнальные аптамеры: общие сведения
Методы отбора аптамеров, описанные в разделах Сайт-направленный отбор аптамеров: введение , Получение аптамеров при подавлении доминирующего эпитопа мишени и Получение аптамеров к конкретному эпитопу белка-мишени позволяют получать высокоаффинные и специфичные аптамеры к различным белкам, но не дают возможности контролировать связывание аптамеров со своими мишенями. В то же время, во многих исследованиях желательно использовать лиганды, связывание которых с белками-мишенями можно было бы регулировать. В частности, подобные аптамеры могут иметь большое значение при изучении функций различных белков на разных стадиях клеточного цикла и в процессе эмбрионального развития ( Vuyisich and Beal, 2002 ). Группа методов отбора, позволяющая получать аптамеры, связывание которых с молекулой- мишенью изменяется в зависимости от присутствия другой молекулы- регулятора, получила название conditional SELEX (от англ. condition - условия) ( Smith and Gold, 2004 ).
В зависимости от целей эксперимента, можно получать аптамеры, либо требующие для своего связывания с белком-мишенью какого-либо соединения, либо, наоборот, неспособные взаимодействовать с мишенью в его присутствии. В первом случае при проведении эксперимента отбирают последовательности, образующие комплекс с белком-мишенью только в присутствии молекулы-регулятора, и не взаимодействующие с мишенью в его отсутствие ( Рис. 7.2 А). Во втором случае все делается наоборот ( Рис. 7.2 Б). Так, например, при отборе аптамеров к формамидопиримидин-гликозилазе (фермент ДНК-репарации) связанные с белком олигонуклеотиды элюировали неомицином ( Vuyisich and Beal, 2002 ). В результате были получены аптамеры, которые были не способны связываться с белком-мишенью в присутствии неомицина.
Аналогичный подход может быть применен для получения сигнальных аптамеров, которые при связывании с белком-мишенью генерируют какой-либо легко-детектируемый сигнал ( Hesselberth et al., 2000 ; Smith and Gold, 2004 ). Сигнальные аптамеры могут быть использованы для детекции различных молекул-мишеней. Так, например, при помощи данного метода можно получить аптамеры, которые связываются с молекулой- флуорофором в отсутствие белка-мишени, а при взаимодействии с белком- мишенью изменяют конформацию, что приводит к диссоциации флуорофора и увеличению сигнала флуоресценции. Один из возможных способов получения сигнальных аптамеров изображен на Рис. 7.3 А.
