Получение аптамеров к конкретному эпитопу белка-мишени
Для получения аптамеров к какому-либо конкретному эпитопу белка- мишени используются следующие методы направленного отбора.
1) Одним из наиболее простых методов направленного отбора аптамеров является конкурентная элюция последовательностей, связанных с молекулой-мишенью, другими лигандами, специфичными к конкретному сайту мишени ( Рис. 7.1 А). В качестве примера можно привести отбор аптамеров к агглютинину (элюция проводилась аналогом природного субстрата, триацетил-хитотриозой, ( Bridonneau et al., 1999 )) и Ile-тРНК-синтетазе (для отбора аптамеров к сайту связывания тРНК элюция проводилась Ile- тРНК, ( Hale and Schimmel, 1996 )). Аналогичная методика может быть использована для отбора аптамеров-ингибиторов, взаимодействующих с сайтами связывания многих известных антибиотиков. Недостаток метода конкурентной элюции заключается в том, что элюции подвергаются только те последовательности, которые находятся в быстром равновесии с раствором, а аптамеры, образующие наиболее прочные комплексы, остаются связанными с белком и теряются при отборе.
2) Аптамеры к определенному домену белка-мишени могут быть получены при помощи процедуры контр-селекции ( Рис. 7.1 Б). В этом случае при отборе библиотеку сначала инкубируют с целым белком-мишенью, а затем проводят селекцию олигонуклеотидов, не взаимодействующих с мутантной формой белка, у которого отсутствует тот участок, к которому требуется получить аптамеры. Подобная методика была использована, например, при отборе аптамеров к домену РНКазы Н обратной транскриптазы вируса HIV-1. Данная процедура может быть использована и в случае сложных мишеней. К примеру, при помощи подобного подхода были получены аптамеры, специфически взаимодействующие с трансформированными клетками глиобластомы, и не узнающие нормальные клетки ( Blank et al., 2001 ). В качестве мишени и "контр-мишени" в данном случае были использованы целые клетки, что позволило получить аптамеры, специфичные к одному из белков, присутствующему в мембранах трансформированных клеток. Было показано, что полученные аптамеры можно использовать в качестве гистологических маркеров для идентификации специфических типов клеток.
3) Отбор аптамеров к конкретному эпитопу можно направить, используя методику "смешанной" селекции (blended SELEX) ( Рис. 7.1 В). В этом случае к олигонуклеотидам случайной библиотеки присоединяется какой-либо низкомолекулярный лиганд, взаимодействующим с данным эпитопом белка. Это может быть сделано либо путем прямой ковалентной сшивки между лигандом и олигонуклеотидом (по 5'- или 3'-концу), либо за счет образования комплементарных взаимодействий между фиксированной областью библиотеки и другим олигонуклеотидом, модифицированным используемым лигандом. Данный подход был применен, например, при отборе аптамеров- ингибиторов эластазы нейтрофилов человека ( Charlton et al., 1997a ). В качестве "направляющего" лиганда был использован относительно малоактивный фосфонатный ингибитор сериновых протеаз, который ингибирует фермент, образуя стабильную ковалентную связь с серином активного центра. В результате проведения отбора были получены новые высокоспецифичные ингибиторы эластазы на основе аптамеров, эффективность действия которых в 100 раз превышала эффективность исходного ингибитора.
В некоторых случаях низкомолекулярный ингибитор может быть присоединен к аптамерам уже после проведения отбора. Так, ковалентное присоединение низкоаффинного тетрапептида-ингибитора эластазы к высокоаффинным ДНК-аптамерам, которые, однако, не являлись ингибиторами фермента, резко повысило эффективность ингибирования. Таким образом, аптамеры в данном случае послужили "якорем" для закрепления другого лиганда в своем сайте связывания ( Lin et al., 1995 ).
Похожий метод можно использовать для селекции более высокоаффинных аптамеров, взаимодействующих поблизости от того же сайта мишени, что и уже полученные аптамеры "первого поколения". Для этого проводят SELEX с использованием библиотеки, в константные районы которой введены последовательности уже известных аптамеров ( Hamm et al., 2002 ).
4) В качестве мишени для отбора аптамеров можно использовать не полноразмерный белок, а отдельный домен белка ( Fukuda et al., 1997 ) или даже короткий пептид, соответствующий нужному эпитопу ( Рис. 7.1 Г). Так, было показано, что аптамеры, полученные к пептиду белка Rev, взаимодействуют с полноразмерным белком и подавляют репликацию вируса HIV-1 ( Xu and Ellington, 1996 ).
Аптамеры к неструктурированному эпитопу прионного белка PrP человека узнают полноразмерный белок PrP и ингибируют образование инфекционной формы белка ( Proske et al., 2002 ). Данный метод позволяет получать аптамеры практически к любому белку с известной последовательностью (например, к различным гипотетическим белкам, идентифицированным в результате секвенирования геномов) ( Gold et al., 2002b ). Эффективность данного метода можно значительно увеличить, если после нескольких раундов отбора против изолированного пептидного фрагмента использовать в качестве мишени целый белок, что позволяет выбрать те из последовательностей, которые опознают искомый эпитоп в его нативной конформации. В случае, если очищенный препарат полноразмерного белка недоступен, в некоторых раундах отбора можно использовать сложные мишени (например, лизаты клеток), которые содержат данный белок ( Bianchini et al., 2001 ; Gold et al., 2002b ). Так как в ходе проведения отбора против пептида библиотека оказывается обогащена лигандами к данному белку, присутствие в сложной мишени других белков не является препятствием для получения высокоспецифичных аптамеров.
5) Наконец, направленный отбор аптамеров может быть основан на антиидиотипическом подходе ( Рис. 7.1 Д). Данный метод используется для получения аптамеров, мимикрирующих какой-либо другой лиганд к белку- мишени (например, другой белок, короткий пептид или низкомолекулярное соединение). На первой стадии эксперимента получают антитела против этого лиганда. Затем отбирают аптамеры против полученных антител. Оказалось, что, как и в случае антиидиотипических антител, получаемые аптамеры оказываются способны взаимодействовать с исходным белком. Так, аптамеры к антителам против пептида белка CREB, который является субстратом для протеин-киназы MSK1, взаимодействуют с субстрат- связывающим центром данной протеин киназы и являются эффективными и специфичными ингибиторами ее активности ( Hamm et al., 2002 ). Аптамеры, полученные против антител, специфичных к сигналу ядерного экспорта (NES, nuclear export signal) белка Rev, взаимодействуют с белком системы ядерного экспорта CRM1 и блокируют Rev-зависимый экспорт РНК из ядра в цитоплазму, ( Hamm and Fornerod, 2000 ; Hamm et al., 1997 ). Более того, данные аптамеры сами экспортируются из ядра, что свидетельствует о высокой схожести их трехмерной структуры со структурой природного NES.
