Различия в скорости синтеза РНК у мезофилов и термофилов
Известно, что ферменты термофильных организмов обычно проявляют сниженную активность по сравнению с гомологичными ферментами мезофильных организмов при одних и тех же температурах. Это, вероятно, является следствием увеличения жесткости структуры белка, что необходимо для повышения термостабильности ( Fields, 2001 ; Golding and Dean, 1998 ; Vieille and Zeikus, 2001 ). Таким образом, сравнение каталитических характеристик РНКП мезофилов и термофилов открывает возможность для поиска функционально-важных участков РНК-полимеразы (РНКП), задействованных в катализе.
Установлено, что РНКП термофильных бактерий действительно проявляют холодочувствительность в синтезе РНК, прежде всего, по сравнению с РНКП E. coli ( Meier et al., 1995 ; Nikiforov, 1971 ; Xue et al., 2000 ). Однако, до настоящего времени не проводилось детальных исследований, направленных на сравнение каталитических свойств РНКП родственных термофильных и мезофильных бактерий, которые позволили бы установить взаимосвязь между различиями в каталитических свойствах РНКП и температурной адаптацией клеток.
Анализ транскрипционных свойств РНКП E. coli , D. radiodurans , T. aquaticus и T. thermophilus показал, что большинство различий данных РНКП в ходе инициации транскрипции не связаны с разной температурной адаптацией бактерий. Это касается, в том числе, изменений в температуре плавления ДНК, стабильности промоторных комплексов и эффективности перехода к элонгации. В частности, было обнаружено, что, несмотря на разную температурную адаптацию, РНКП D. radiodurans и T. aquaticus проявляют сходную холодочувствительность в открывании промоторов.
В то же время, сравнение температурных профилей активности РНКП E. coli, D. radiodurans и T. aquaticus позволило выявить значительные различия между данными РНКП, которые, вероятно, связаны с разной температурной адаптацией ( Рис. 7.1 ). Измерение активности РНКП при разных температурах было проведено на фрагменте ДНК, содержащем Т7A1- промотор. Показано, что, в то время как РНКП мезофильных бактерий E. coli и D. radiodurans проявляют максимальную активность при 37-45 градусах по С, РНКП термофильных бактерий T. aquaticus и T. thermophilus практически неактивны при этих температурах, оптимум их активности составляет 60-70 градусов ( Рис. 7.1 ).
Так как РНКП D. radiodurans и T. aquaticus не различаются по температурной зависимости открывания промоторов, изменения температурных профилей активности данных РНКП не могут быть связаны с различиями в открывании промоторов, а должны, вероятно, объясняться особенностями каталитических свойств РНКП.
Для точного измерения скорости катализа различных РНКП была использована синтетическая минимальная матрица, которая позволяет исследовать удлинение РНК-транскрипта на один нуклеотид, происходящее в ходе единичного каталитического цикла РНКП. Было исследовано присоединение UTP (комплементарного матричной цепи ДНК) к РНК-олигонуклеотиду длиной 8 нт, входящему в состав минимальной матрицы. Измерения кинетики присоединения нуклеотида проведены при насыщающей концентрации UTP. Показано, что РНКП D. radiodurans осуществляет присоединение нуклеотида с гораздо большей скоростью, чем РНКП T. aquaticus. Время, необходимое для удлинения половины РНК при 20 градусах, составляет примерно 10 миллисекунд для РНКП D. radiodurans и около 3 секунд для РНКП T. aquaticus ( Рис. 7.2 и Рис. 7.5 ). Разница в скорости катализа оказывается особенно заметной при низких температурах (20 градусов и ниже). Вероятно, именно разница в скорости катализа является причиной значительных различий в температурных профилях активности данных РНКП. Следует подчеркнуть, что разница в скоростях синтеза РНК является единственным выявленным различием РНКП T. aquaticus и D. radiodurans, связанным с различной температурной адаптацией клеток.
