Синтетические промоторы на основе аптамеров
Аптамеры к сигма-субъединице T. aquaticus содержат в своем составе несколько мотивов (-10, TG и GGGA-элементы), которые специфически узнаются сигмаA-субъединицей. Это позволило предположить, что аптамерные последовательности в двунитевом состоянии могут являться промоторами, узнаваемыми холоферментом РНК-полимеразой (РНКП) T. aquaticus. На двунитевых фрагментах ДНК, содержащих аптамерные последовательности (sTap1-4), подтверждено, что, как и в случае природных промоторов, инициация транскрипции на аптамерных промоторах происходит на расстоянии 6-7 нуклеотидов правее -10 элемента. Анализ последовательностей аптамеров показал, что они не содержат -35 элемента, и, следовательно, этот элемент не нужен для активности аптамерных промоторов ( Рис. 3.1 А). Экспериментально установлено, что активность РНКП T. aquaticus на промоторе sTap2 в отсутствие -35 элемента обеспечивается одновременным присутствием -10 и GGGA-элементов. Анализ точечных замен в промоторном элементе GGGA показал, что для его узнавания важны все четыре нуклеотида, причем наибольшее значение имеют первые три из них ( Рис. 3.1 Г).
В отличие от РНКП T. aquaticus, РНКП E. coli не проявляет активности на промоторах, полученных на основе sTap-аптамеров ( Рис. 3.1 Б). Это свойство аптамерных промоторов очень необычно, так как большинство известных природных промоторов узнаются РНКП разных бактерий. Определено, что аптамерные последовательности не содержат каких-либо специфических элементов, ингибирующих транскрипцию РНКП E. coli, так как в присутствии -35 элемента РНКП E. coli способна эффективно транскрибировать аптамерные матрицы (промоторы sTap2+35, sTap2+35-TG и sTap2+35-GGGA, Рис. 3.1 А,В).
Способность к узнаванию GGGA-содержащих промоторов РНКП T. aquaticus не связана с температурной адаптацией этой бактерии, так как РНКП Deinococcus radiodurans , близкородственной мезофильной бактерии, также способна узнавать аптамерные матрицы в отсутствие -35 элемента ( Рис. 3.1 Д). В то же время, РНКП мезофильной бактерии Bacillus subtilis не активна на данном промоторе ( Рис. 3.1 Д).
Таким образом, способность узнавать GGGA-содержащие промоторы в отсутствие -35 элемента, по-видимому, характерна для бактерий группы Thermus/Deinococcus.
