Структурные элементы сигма-субъединицы РНКП: плавление промоторов
Структурные элементы сигма-субъединицы РНКП, участвующие в плавлении промоторов.
Для поиска функционально-важных участков сигма-субъединицы, задействованных в плавлении промоторов, были сконструированы три мозаичных варианта сигма70-субъединицы E. coli с заменой отдельных районов на гомологичные последовательности T. aquaticus - сигма ЕЕТ, ЕТЕ и ТЕЕ. В сигма ЕЕТ была заменена С-концевая часть, включающая районы 3 и 4 (аминокислотные остатки 456-613 по нумерации E. coli), в сигма ЕТЕ - район 2 (остатки 386-455), а в сигма ТЕЕ - N-концевая часть, включающая район 1 и неконсервативный участок между районами 1 и 2 (остатки 1-385).
Анализ плавления промотора РНКП E. coli, содержащей мозаичные сигма-субъединицы, показал, что холодочувствительность открывания промоторов наблюдается только в случае сигма-субъединиц ЕТЕ и ТЕЕ ( Рис. 4.3 , дор. 5-8), а сигма ЕЕТ не отличается по эффективности плавления ДНК при 20 градусах по С от сигма70-субъединицы дикого типа ( Рис. 4.3 , дор. 9,10). Следовательно, холодочувствительность открывания промоторов сигма-субъединицей T. aquaticus определяется N-концевой частью белка и консервативным районом 2.
N-концевая часть сигма значительно различается у E. coli и T. aquaticus, что затрудняет поиск индивидуальных аминокислотных остатков, ответственных за различия в температуре открывания промоторов. В то же время, в районе 2 сигмаA-субъединицы T. aquaticus имеется всего 12 аминокислотных замен, а в сигмаA-субъединице D. radiodurans - 10 замен в сравнении с сигма70-субъединицей E. coli ( Рис. 4.4 ). Это позволило установить, какие из данных замен влияют на температуру открывания промоторов.
Для анализа роли индивидуальных аминокислотных замен в районе 2 в плавлении промоторов был получен набор мозаичных вариантов сигма70- субъединицы ( Рис. 4.4 ). Исследование плавления промоторов РНКП, содержащими мозаичные сигма-субъединицы, позволило установить, что холодочувствительность открывания промоторов, наблюдаемая у мозаичной сигма-субъединицы ЕТЕ по сравнению с сигма70-субъединицей, объясняется комбинированным эффектом аминокислотных замен в различных подрайонах района 2 сигма-субъединицы. Установлено также, что замены, присутствующие в сигмаA B. subtilis, не влияют на температуру плавления промоторов ( Рис. 4.4 ).
Ранее было показано, что мутации в подрайонах 2.1 и 2.2 сигма70- субъединицы E. coli влияют на взаимодействие сигма с кор-ферментом РНКП ( Sharp et al., 1999 ). Замены в подрайонах 2.1 и 2.2 затрагивают аминокислоты, взаимодействующие с бета'-субъединицей кор-фермента РНКП ( Рис. 4.5 ) и влияют на плавление ДНК. Эффект данных замен, вероятно, объясняется изменением контактов сигма с кор-ферментом, что может приводить к изменению локальной конформации подрайонов 2.3 и 2.4, непосредственно взаимодействующих с ДНК.
Замена в петле, соединяющей две альфа-спирали, которые взаимодействуют с кор-ферментом и с ДНК подрайона 2.3, вероятно, приводит к снижению конформационной подвижности района 2 сигма- субъединицы (так как конформационно гибкий глицин заменяется на аргинин), что может затруднить плавление промотора. Действительно, локальная конформационная подвижность района 2 сигма-субъединицы важна для узнавания -10 элемента промотора ( Anthony and Burgess, 2002 ).
Замены в подрайонах 2.2 и 2.4 затрагивают аминокислоты, напрямую взаимодействующие с ДНК при узнавании и открывании промотора ( Fenton et al., 2000 ; Tomsic et al., 2001 ). В частности, было показано, что мутация K414A в РНКП E. coli приводит к серьезным дефектам в плавлении промотора ( Tomsic et al., 2001 ), а мутации T440I и T440S влияют на узнавание первого нуклеотида -10 элемента промотора и нарушают плавление промотора ( Fenton et al., 2000 ; Gross et al., 1998 ). Таким образом, замены данных остатков в сигма-субъединице, вероятно, непосредственно влияют на процесс плавления ДНК.
В целом, полученные данные показывают, что замены неконсервативных аминокислот в различных участках района 2 сигма-субъединицы совместно влияют на температуру открывания промоторов за счет изменения конформационной подвижности сигма-субъединицы и ее контактов с кор- ферментом и с ДНК. Следовательно замены неконсервативных аминокислот в различных участках района 2 сигма-субъединицы у разных бактерий могут обеспечивать различия в транскрипционных свойствах РНКП.
