Различия в стабильности промоторных комплексов
Различия в стабильности промоторных комплексов РНК-полимеразы (РНКП) E. coli , T. aquaticus и D. radiodurans .
При поиске структурных элементов РНКП, определяющих, возможно, межвидовые различия в стабильности промоторных комплексов, были использованы РНК-полимеразы (РНКП) E. coli, D. radiodurans и T. aquaticus. Установлено, что РНКП T. aquaticus образует гораздо менее стабильные промоторные комплексы, чем РНКП E. coli на тех же промоторах. Так, время полужизни промоторных комплексов T. aquaticus РНКП на промоторе Т7A1 составляет менее 30 секунд и приблизительно 60 минут для РНКП E. coli ( Рис. 4.10 А).
Аналогичный результат был получен при исследовании транскрипции РНКП T. aquaticus на других промоторах - на природных (dnaK) и синтетических промоторах, полученных на основе аптамеров (sTap2, см. " Аптамеры sEcap и sTap: взаимодействие с сигма-субъединицами "). Что не связано с термофильной адаптацией, так как РНКП мезофильной бактерии D. radiodurans также образует нестабильные промоторные комплексы. По- видимому, низкая стабильность промоторных комплексов РНКП T. aquaticus и D. radiodurans связана с особенностями регуляции транскрипции у этих бактерий.
Чтобы установить, какой из компонентов холофермента - кор-фермент или сигма-субъединица - определяет обнаруженные различия в стабильности промоторных комплексов, были исследовали гибридные холоферменты, состоящие из кор-фермента E. coli и сигмаA-субъединиц T. aquaticus или D. radiodurans. Измерение кинетики диссоциации промоторных комплексов гибридных РНКП установило промежуточную стабильность комплексов ( Рис. 4.10 А). Так что изменения стабильности комплексов РНКП E. coli, D. radiodurans и T. aquaticus определяются как сигма-субъединицей, так и кор-ферментом РНКП.
Различия, определяемые кор-ферментом РНКП, могут быть связаны с особенностями структуры районов clamp и switch2 бета'-субъединицы, контактирующих с ДНК спереди по ходу транскрипции (см. " Стабилизация промоторного комплекса: контакты кор-фермента с ДНК "). Поскольку в сравнении с РНКП E. coli РНКП T. aquaticus в промоторных комплексах имеет укороченный футпринт спереди по ходу транскрипции, что и свидетельствует о разных контактах РНКП с передним дуплексом ДНК ( Kuznedelov et al., 2003 ).
Для выявления районов сигма-субъединицы, участвующих в стабилизации промоторных комплексов и определяющих изменения стабильности комплексов между РНКП E. coli и T. aquaticus, были исследованы холоферменты, состоящие из кор-фермента E. coli и мозаичных сигма-субъединиц ЕЕТ, ЕТЕ и ТЕЕ (см. " Структурные элементы сигма-субъединицы РНКП: плавление промоторов "). Стабильность комплексов РНКП, содержащих мозаичные сигма-субъединицы, была измерена при различных концентрациях гепарина ( Рис. 4.10 Б). Установлено, что сниженной стабильностью промоторных комплексов обладает только РНКП, содержащая сигма ТЕЕ, в то время как стабильности остальных двух РНКП не отличаются от стабильности холофермента E. coli ( Рис. 4.10 Б).
Сигма-субъединица ТЕЕ содержит N-концевую часть сигма-субъединицы T. aquaticus, включающую консервативные районы 1.1 и 1.2. Следовательно, межвидовые различия в стабильности промоторных комплексов могут определяться изменениями в структуре этих районов сигма-субъединицы. Стоит отметить, что ранее было показано, что на стабильность промоторных комплексов влияют мутации консервативных аминокислот в районе 2 ( Fenton et al., 2000 ), а также мутации в районах 1.1 и 1.2 сигма70- субъединицы РНКП E. coli ( Vuthoori et al., 2001 ). Эффект мутаций в районе 2 объяснялся изменением контактов с -10 элементом и нарушением плавления ДНК. Возможная функциональная роль районов 1.1 и 1.2 сигма в стабилизации промоторных комплексов оставалась неясной. Район 1.1 сигма в холоферменте РНКП располагается в ДНК-связывающем канале спереди по ходу транскрипции ( Рис. 2.1 ) ( Mekler et al., 2002 ; Vassylyev et al., 2002 ). Можно предположить, что этот район влияет на стабильность комплексов за счет конкуренции с передним дуплексом ДНК при образовании промоторного комплекса. Роль района 1.2 в стабилизации комплексов может объясняться его контактами как с кор-ферментом РНКП, так и с промоторной ДНК в области GGGA-элемента ( Рис. 2.1 ). Действительно, контакты района 1.2 сигма-субъединицы с GGGA обеспечивают значительную стабилизацию промоторных комплексов (см. " GGGA-элемент: стабилизация промоторных комплексов ").
Различия в структуре контактов района 1.2 с ДНК, вероятно, могут определять изменения стабильности промоторных комплексов РНКП разных бактерий.
