Трехмерная структура аптамер-белковых комплексов
В настоящее время информация о трехмерной структуре комплексов аптамеров с белковыми мишенями является весьма ограниченной. Методами рентгеноструктурного анализа была определена структура комплексов аптамеров с тромбином (РНК- и ДНК- аптамеры), с белком оболочки фага MS2 (РНК-аптамеры), с обратной транскриптазой вируса HIV-1 (РНК-аптамер), с транскрипционным фактором NF-каппаB (РНК-аптамер) и с РНКП II S. cerevisiae (РНК-аптамер). Анализ комплекса ДНК-аптамера с тромбином показывает, что при образовании комплекса и ДНК, и белок сохраняют ту же конформацию, которую они имели в растворе ( Рис. 8.1 А) ( Padmanabhan et al., 1993 ). Аптамер длиной 15 нт имеет структуру G-квартета ( Bock et al., 1992 ), которая способна образовываться в растворе в отсутствие тромбина ( Schultze et al., 1994 ). Аптамер связывается с фибриноген-связывающим сайтом тромбина, контактируя всего с тремя аминокислотными остатками. Специфичность узнавания аптамера определяется при этом не сиквенс-специфическими ДНК-белковыми контактами, а трехмерной структурой ДНК. Структура комплекса другого G-квартетного ДНК-аптамера с тромбином была смоделирована на основании данных по ДНК-белковым сшивкам ( Tasset et al., 1997 ). В этом случае связывание лиганда происходит с другой стороны тромбина (с гепарин- связывающим сайтом), и в контактах принимает участие другая "сторона" G-квартета. Была расшифрована структура комплекса тромбина с РНК- аптамером, формирующим структуру шпильки ( Рис. 8.1 Б) ( Long et al., 2008 ). Аптамер также связывается с гепарин-связывающим сайтом тромбина и формирует очень плотные контакты, включающие стэкинг- взаимодействия адениновых оснований с остатками аргинина белка ( Рис. 8.1 Б).
В случае белка оболочки фага MS2 было проанализировано несколько комплексов с разными аптамерами (длиной от 14 до 19 нт) ( Рис. 8.2 А) ( Convery et al., 1998 ; Rowsell et al., 1998 ). Последовательность исследованных РНК-аптамеров была весьма похожа на природную шпильку трансляционного оператора, узнаваемую этим белком. Было обнаружено, что конформация белка при связывании аптамеров не меняется, а структура РНК претерпевает определенные изменения. Как вирусная РНК, так и аптамеры содержат два неспаренных адениновых остатка, которые в свободной РНК уложены в стопку между двумя спиральными участками, а в комплексе с белком выпетливаются и оказываются вне спирали. Для специфического узнавания аптамера важны всего три основания РНК: два вышеописанных аденина, образующих водородные связи внутри гидрофобных карманов белковой молекулы, и цитозин, участвующий в стэкинг-взаимодействии с одним из тирозинов. Интересно, что, хотя несколько исследованных аптамеров отличались по своей вторичной структуре (по длине шпильки и петли из неспаренных нуклеотидов), большинство РНК-белковых контактов были сохранены во всех комплексах. Помимо перечисленных выше специфических контактов, во взаимодействии с белком MS2 участвуют остатки рибозы, а также фосфатные группы. Таким образом, для связывания аптамера оказываются важны практически все функциональные группы РНК.
В лаборатории Т. Стэйца была расшифрована трехмерная структура комплекса обратной транскриптазы HIV-1 с РНК-аптамером длиной 33 нт, имеющим форму псевдоузла (см. " Структурные особенности аптамеров "), ( Рис. 8.1 Б) ( Jaeger et al., 1998 ). Вирусный белок является гетеродимером из двух субъединиц: p66 и p51 . Обе субъединицы имеют одинаковую N-концевую последовательность, но у р51 отсутствует домен РНКазы Н. Все каталитические функции выполняются р66, а р51 играет архитектурную роль. РНК-псевдоузел помещается внутри субстрат- связывающего кармана фермента, в том участке, где в норме должна располагаться матричная нить с 3'-концевой частью синтезируемой молекулы ДНК. Ни белок, ни РНК-лиганд не претерпевают существенных конформационных изменений в результате образования комплекса. В то же время, аптамер, вероятно, стабилизирует закрытую конформацию фермента. Аптамер образует более плотные контакты с обратной транскриптазой, чем природный ДНК-субстрат. Вероятно, это объясняется тем, что в комплексе с ДНК должна сохраняться латеральная подвижность нуклеиновой кислоты относительно фермента, а отбор аптамеров был направлен на идентификацию лигандов, образующих как можно более прочные комплексы с ферментом.
В комплексе транскрипционного фактора NF-каппаB РНК-аптамер связывается в том же участке, что и дцДНК природного сайта узнавания NF-каппаB ( Рис. 8.2 В) ( Reiter et al., 2008 ). Аптамер имеет длину 29 нт и формирует структуру неправильной шпильки, содержащей два двунитевых участка длиной 4 и 5 нт. Большая бороздка аптамера приближается по структуре к B-форме ДНК, что, по-видимому, и обеспечивает мимикрию при узнавании РНК-аптамера. Каждая молекула аптамера взаимодействует с одной из двух молекул в димере NF-каппаB. Связывание двух молекул аптамера приводит к увеличению расстояния между ДНК-связывающими сайтами NF- каппаB и изменению взаимного располоожения двух мономеров белка в составе димера ( Рис. 8.2 В).
На основе рассмотренных примеров можно сделать вывод, что связывание аптамеров обычно не вызывает значительных структурных изменений самого аптамера и его сайта связывания на белке-мишени. В случае ДНК и РНК-связывающих белков аптамеры связываются в природных сайтах связывания нуклеиновых кислот, причем структура контактов аптамера с белком-мишенью оказывается очень сходной с контактами природного субстрата. Ингибирование аптамерами активности белков-мишеней в данном случае, вероятно, объясняется простой конкуренцией аптамера с природными субстратами РНК и ДНК.
С этой точки зрения наиболее интересным примером является РНК- аптамер к РНКП II S. cerevisiae ( Рис. 8.3 А) ( Thomas et al., 1997 ). Аптамер, получивший название FC, имеет длину 33 нт и формирует структуру из двух шпилек, соединенных неспаренным участком. Анализ комплекса аптамера с РНКП II показал, что он связывается внутри главного канала РНКП, в его передней части ( Kettenberger et al., 2006b ). Связывание аптамера не препятствует первоначальному узнавания промотора и образованию закрытого комплекса , но препятствует попаданию ДНК в главный канал РНКП и образованию открытого комплекса ( Рис. 8.3 Б). Предполагается, что по аналогичному механизму могут действовать регуляторные РНК, ингибирующие РНКП. Одним из примеров таких РНК является РНК B2 млекопитающих, подавляющая активность РНКП II ( Allen et al., 2004 ; Espinoza et al., 2004 ; Kettenberger et al., 2006a ).
