Узнавание шпилечных матриц холоферментом РНК-полимеразы
При определении оптимальных последовательностей однонитевой ДНК для связывания с холоферментом РНКП и изучении роли вторичной структуры в их узнавании был проведен отбор однонитевых ДНК- аптамеров к холоферментам РНК-полимеразы (РНКП) E. coli и T. aquaticus - hEcap (от holo E. coli aptamer) и hTap (holo T. aquaticus aptamer), соответственно. Анализ последовательностей аптамеров показал, что большинство из них содержат TG и -10-элементы промотора и образуют структуру шпилек, в которых TG-элемент входит в состав двунитевой части, а -10 элемент находится в составе однонитевой петли (размеры петли у разных аптамеров различны) ( Рис. 4.1 А и Б). Такая структура соответствует структуре расплавленного участка промотора в области -10 элемента.
Показано, что аптамеры связываются с РНКП с высокой аффинностью ( Табл. 4.1 ), сравнимой с аффинностью холофермента к промоторам. На основе предсказаний вторичной структуры получены минимальные варианты аптамеров ( Рис. 4.1 Б), связывающиеся с холоферментом РНКП с такой же эффективностью, как и полноразмерные варианты. Для определения роли специфических РНКП-ДНК взаимодействий в узнавании аптамеров, получены и исследованы мутантные варианты аптамеров hEcap5 и hTap12 с заменами в TG и в -10 элементах (TG на AC и замена A на С во втором положении -10 элемента). Показано, что эти замены серьезно нарушают связывание аптамеров ( Табл. 4.1 ). Следовательно, для узнавания аптамеров важна как специфическая шпилечная структура, так и наличие промоторных элементов в их составе.
Аптамеры к холоферментам РНКП E. coli и T. aquaticus имеют сходную структуру ( Рис. 4.1 ). Некоторые из них способны взаимодействовать с обеими РНКП (например, hEcap2, hEcap6, Табл. 4.1 ). Аптамеры, полученные при отборе к холоферменту РНКП T. aquaticus, способны также взаимодействовать с холоферментом РНКП родственной бактерии T. thermophilus . Таким образом, способность узнавать данный тип ДНК- матриц может являться общим свойством РНКП различных бактерий. В то же время показана высокая специфичность некоторых аптамеров к своим РНКП- мишеням. Такие аптамеры узнают или только РНКП E. coli (например, hEcap5), или только РНКП T. aquaticus (например, hTap12) ( Табл. 4.1 ). На специфичность узнавания аптамеров в данном случае могут влиять последовательности ДНК как в двунитевом, так и в однонитевом участке.
Вероятно, дальнейший анализ аптамеров может привести к выявлению дополнительных промоторных мотивов, определяющих видоспецифические различия в узнавании промоторов.
Чтобы установить, способны ли аптамеры служить матрицами для специфической инициации транскрипции, были исследованы транскрипционные свойства hEcap6. Для изучения процесса инициации в участок однонитевой петли этого аптамера - возможной точке инициации транскрипции - было внесено несколько дополнительных нуклеотидов ( Рис. 4.1 А).
Обнаружено, что РНКП E. coli способна синтезировать на удлиненном варианте аптамера тринуклеотидный РНК-продукт, используя в качестве субстратов динуклеотидную затравку UpA и нуклеотид UTP ( Рис. 4.1 Б). Точка инициации транскрипции, соответствующая данной затравке, расположена в hEcap6 на расстоянии 6 нт от -10 промоторного элемента. Следовательно, инициация транскрипции на шпилечных матрицах происходит на таком же расстоянии от -10 элемента, как и в случае двунитевых промоторов.
Для проверки специфичности узнавания аптамерных матриц исследованы варианты матрицы hEcap6 с мутациями в TG и -10 элементах. Показано, что замена TG элемента нарушает, а замена -10 элемента полностью подавляет специфическую инициацию транскрипции ( Рис. 4.1 Б ). Следовательно, эффективное узнавание данной матрицы холоферментом РНКП зависит от наличия в ней промоторных элементов.
Таким образом, оптимальными для узнавания холоферментом РНКП являются ДНК-субстраты, имеющие шпилечную структуру, и содержащие в составе шпильки -10 и TG-элементы промотора. Способность узнавать такой тип ДНК-структур, по-видимому, лежит в основе плавления промоторов холоферментом РНКП.
