Анализ микробного сообщества в районе станций Ленинградская и Дружная
Анализ таксономического состава микробного сообщества поверхностного снега в районе станций Ленинградская и Дружная.
Менее 1% бактерий, присутствующих в природных образцах, было получено в чистых культурах [ 8 ]. Поэтому для оценки разнообразия снежных бактерий Антарктиды были использованы молекулярно-генетические методы. Были приготовлены четыре библиотеки клонов фрагментов генов 16S рРНК , амплифицированных с препаратов ДНК, выделенных из талого снега, собранного на станциях Ленинградская и Дружная в ходе 54-й и 55-й РАЭ . Фрагменты генов 16S рРНК бактерий длиной примерно 1500 п.о. амплифицировали с помощью вырожденных бактериальных праймеров 27F и 1492R, широко используемых для изучения разнообразия микробных сообществ [ 127 ]. Амплифицированные фрагменты клонировали в плазмиду pGEM-T , а затем определяли последовательности вставок в случайно выбранных индивидуальных рекомбинантных плазмидных клонах. Всего было проанализировано около 450 клонов ( Табл. 5 ).
Для того, чтобы определить таксономическую принадлежность микроорганизмов в образцах, мы сравнили последовательности вставок клонированных фрагментов 16S рРНК генов с последовательностями в базе данных RDP, как описано в разделе " МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ РАЗНООБРАЗИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ СНЕГА АНТАРКТИДЫ ". В библиотеках клонов, приготовленных из образцов со станции Дружная (54-й сезон), Ленинградская (54-й сезон), Дружная (55-й сезон) и Ленинградская (55-й сезон), обнаружили последовательности, соответствующие 18, 23, 10 и 18 различным родам бактерий, соответственно. Покрытие для библиотек клонов со станции Ленинградская по двум стандартным статистическим оценкам Гуда и Чао составляло 89,8% и 94,8% для 54-го сезона, и 98,3% и 87,5% для 55-го сезона; для станции Дружная - 78,4% и 93% для 54-го сезона, и 95,6% и 95,7% для 55-го сезона, т.е., было выше средних значений этих оценок, считающихся необходимыми для достоверной характеристики разнообразия в библиотеках [ 149 ]. Индекс Симпсона , который является мерой выровненности представленности таксонов внутри сообщества, для всех четырех библиотек был достаточно низким, т.е., ни одна из филогенетических групп не доминировала в образцах и, следовательно, не вносила серьезных искажений в общее разнообразие. Индекс Шеннона , который оценивает таксономическое разнообразие в образце с учетом вклада каждого таксона в сообщество, изменялся от 1,75 до 2,49 в образцах со станции Дружная 54-го сезона и Ленинградская 55-го сезона, соответственно. Полученные значения характерны и для других снежных и ледниковых сообществ [ 150 , 151 ]. Для сравнения, в более сложных микробных сообществах, например, из почв, индекс Шеннона варьирует от 2,4 до 3,6 [ 152 , 153 ]. Таким образом, микробные сообщества снегов гораздо более простые, чем почвенные сообщества.
Как показано на Рис. 7 , в библиотеках клонов гена 16S рРНК были идентифицированы представители восьми классов бактерий: Alphaproteobacteria , Betaproteobacteria , Gammaproteobacteria , Deltaproteobacteria , Bacteroidetes , Actinobacteria , Verrucomicrobiae и Firmicutes . Betaproteobacteria были самым многочисленным классом и составляли от 39,3% до 82,5% от общего числа клонов на станции Ленинградская (54-й сезон) и Дружная (55-й сезон), соответственно. В образце со станции Дружная 54-го сезона второй по численности таксономической группой были Alphaproteobacteria , а в 55-го сезоне - Gammaproteobacteria . На станции Ленинградская 54-го сезона Alphaproteobacteria составляли треть всей библиотеки клонов, однако через год их доля в сообществе составила всего 13,8%, в то же время доля Gammaproteobacteria возросла с 12,3% до 22,3%.
Как видно из Рис. 8 , Janthinobacteria , Prosthecobacter , Sphingomonas и Caulobacter были самыми многочисленными родами в образцах со станции Дружная 54-го сезона и составляли, соответственно, 24,2%, 12,6%, 12,6% и 10,5%. Год спустя, в образце, собранном на том же месте, доля Janthinobacteria выросла до 36%, а три других наиболее многочисленных рода прошлого года не были детектированы. В образцах со станции Ленинградская самыми многочисленными в 54-м сезоне были представители родов Novosphingobium (21,4%), Janthinobacteria (14,3%), Acidovorax (12,5%) и Pseudomonas (9,8%), однако в образце 55-го сезона эти роды практически не детектировались, уступив место представителям родов Comamonas (20,8%), Rhodoferax (18,5%) и Ralstonia (13,1%).
Сравнительный анализ таксономического состава бактерий в образцах двух сезонов с помощью расчета коэффициента корреляции Пирсона выявил среднюю корреляцию на станции Дружная (r=0,54, p-value < 0,05), и отсутствие корреляции на станции Ленинградская. Между образцами на станции Ленинградская и Дружная, собранными в ходе 54-й РАЭ , была получена средняя корреляция (r=0,52, p-value < 0,05), однако для образцов 55-го сезона корреляции не было. Таким образом, микробные сообщества снега различаются как между двумя станциями, так в пределах одной станции, по крайней мере в течение 12 месяцев.
Содержание питательных веществ на поверхности снега крайне мало. Автотрофные прокариотические организмы, способные синтезировать органические молекулы, могли бы играть важную роль в снежной экосистеме, выступая в качестве первого звена питательной цепи. Такими автотрофными организмами являются цианобактерии , представители которых ранее были неоднократно детектированы на поверхности снега Антарктиды [ 5 , 14 ]. Однако последовательности 16S рРНК генов цианобактерий в полученных нами библиотеках клонов обнаружены не были. Это может указывать на их незначительное количество в наших образцах. Также возможно, что использованные вырожденные бактериальные праймеры к генам 16S рРНК были менее эффективны для амплификации генов цианобактерий. Для направленной амплификации фрагментов генов 16S рРНК цианобактерий мы использовали ранее описанные специфические праймеры [ 129 ]. С этими праймерами нам удалось получить незначительное количество ампликонов из образцов талой воды со станций Ленинградская и Дружная 54-го сезона. Большая часть клонированных последовательностей, амплифицированных с помощью специфических к генам цианобактерий праймеров, были сходны с последовательностями Phormidium и Anabaena . Остальные последовательности были сходны с последовательностями ДНК хлоропластов одноклеточной водоросли Chlorella sacchatophila . Ближайшие родственники этой водоросли были найдены в леднике Миттиваккат в Гренландии и в поверхностном льду озера Вида в Антарктиде . В целом, результаты указывают на то, что количество цианобактерий или фотосинтезирующих водорослей в проанализированных образцах крайне незначительно.
Препараты ДНК, выделенные из образцов поверхностного антарктического снега, были также исследованы на наличие гена 16S рРНК архей . В предыдущих работах наличие ДНК архей было показано в полярных морских водах [ 154 ] и в высокогорьях Арктики [ 155 ]. С другой стороны, последовательности архей не были обнаружены в библиотеках клонов в образцах поверхностного снега ледника Монт Бланк (Франция) [ 156 ]. ПЦР с праймерами, специфичными к гену 16 рРНК архей [ 130 ], не привела к получению продукта амплификации ни для одного из изученных нами образцов, что может означать их крайне незначительное количество или полное отсутствие.
В образцах 54-го сезона не было найдено совпадений между бактериями, найденными в ходе анализа библиотек фрагментов генов 16S рРНК, и изолированными микробиологическим методом. Единственным исключением оказался род Pseudomonas со станции Ленинградская, который детектировался обоими методами. Напротив, для большинства выделенных из образцов 55-го сезона бактерий были обнаружены соответствия при анализе библиотек 16S рРНК этого сезона.
