Анализ спейсеров антарктических Flavobacterium psychrophilum
Сравнительный анализ кластеров спейсеров антарктических F. psychrophilum с последовательностями в общедоступных базах данных
Коллекцию спейсеров F. psychrophilum сравнили с нуклеотидной базой данных GenBank. Ни один из кластеров не имел соответствий сo 117-ю спейсерами, присутствующими в отсеквенированных геномах F. psychrophilum. Лишь три кластера спейсеров соответствовали фрагментам геномов флавобактериофагов FCL-2 и флавобактериофагов 6H . Кроме того, еще два кластера спейсеров соответствовали последовательностям ДНК в хромосоме Flavobacterium ( Таблица 4 Приложения ). Интересно, спейсеры из одного из кластеров соответствовали множественным последовательностям в хромосомах различных флавобактерий, а именно: 22 последовательностям в геноме Flavobacterium indicum , пяти последовательностям в геноме Flavobacterium psychrophilum , и уникальным последовательностям в геномах Flavobacterium columnare и Flavobacterium branchiophilum . Дополнительный анализ геномного контекста этих необычных протоспейсеров выявил, что они являются частью несовершенных палиндромных некодирующих повторов длиной 125 п.о., разбросанных по геномам F. indicum и F. psychrophilum. Функция этих повторов неизвестна. Они имеют тенденцию располагаться в межгенных областях, и генетическое окружение таких областей часто состоит из генов транспозаз , систем рестрикции-модификации, и систем абортивной инфекции. Координаты и численность таких повторов отличаются в разных изолятах флавобактерий . Ранее проведенный сравнительный анализ геномов флавобактерий показал потерю соответствий в порядке генов между разными штаммами ввиду присутствия большого количества повторяющихся IS и rhs элементов [ 185 ]. 125-ти нуклеотидный повтор, найденный в ходе нашего анализа, отличается от IS или rhs элементов, однако может играть сходную роль в обеспечении пластичности генома флавобактерий. Соответствие этого повтора спейсеру CRISPR-Cas системы возможно означает участие CRISPR-Cas в контроле распространения подобных элементов по геному флавобактерий.
Обнаружение протоспейсеров для некоторых кластеров спейсеров позволило провести поиск PAM мотивов CRISPR-Cas системы F. psychrophilum. Мы сравнили полученный нами набор спейсеров (8196 кластеров спейсеров) и 117 уникальных спейсеров F. psychrophilum из базы данных с последовательностями фагов и плазмид флавобактерий, находящимися в базе данных Genbank. Было получено 24 соответствий с последовательностями бактериофагов, причем для антарктических спейсеров было найдено только четыре соответствия, а остальные 20 - для спейсеров из базы данных. Этот неожиданный результат можно объяснить тем, что изоляты F. psychrophilum, также как и фаги флавобактерий, последовательности которых находятся в базе данных, были выделены на территории Северного полушария.
Поиск новых PAM мотивов для CRISPR-Cas систем II типа позволяет увеличить количество доступных мишеней при разработке методов редактирования геномов эукариот на основе CRISPR/Cas9 технологии [ 186 ]. С помощью Weblogo сервиса сравнивали последовательности, прилегающие к 3'-концам обнаруженных протоспейсеров. Таким образом выявили консервативную последовательность ATAТ в двух нуклеотидах от конца протоспейсера ( Рис. 19 ), которая, возможно, является PAM мотивом II-C CRISPR-Cas системы F. psychrophilum. Этот мотив отличен от известных PAM последовательностей CRISPR/Cas9 систем .
Мы также сравнили набор кластеров спейсеров с метагеномными последовательностями, полученными в настоящем исследовании, и метагеномными последовательностями из образцов умеренных экосистем, которые собраны в env_nt базе данных GenBank. В ходе анализа было получено 435 соответствий с антарктическими метагеномными последовательностями, и всего 247 соответствий с последовательностями из базы данных env_nt. Это может означать, что CRISPR-Cas система антарктических флавобактерий обеспечивает защиту бактериальных клеток от эндогенных антарктических вирусов или плазмид, последовательности геномов которых пока еще не определены. Подобное наблюдение большего соответствия последовательностей спейсеров метагеномных последовательностям из того же образца, но не из образцов из общедоступных баз данных, было ранее сделано для экосистемы слива кислотных шахтных вод [ 187 ].
