Измерение включения радиоактивно меченных тимидина и лейцина в клетки
Измерение включения радиоактивно меченных тимидина и лейцина проводили по методике, описанной в работе Карпентера и соавторов [ 5 ]. Снег с глубины 1-5 см собирали в стерильную полипропиленовую пробирку объемом 50 мл. Для внесения метки использовали стерильный шприц, иголку которого предварительно загибали книзу, чтобы струя жидкости разбрызгивалась в разные стороны и равномерно орошала снег. К образцу снега добавляли 0,5 мл [метил-3H]тимидина (молярная активность 55 Ки/ммоль) или 0,5 мл [3H]L-лейцина (молярная активность 35 Ки/ммоль). Пробирки оставляли непосредственно на месте сбора притопленными в снег на 90 мин., после чего к образцу добавляли несколько мл 50% ТХУ до конечной концентрации 5%. Образцы немедленно растапливали, после чего осаждали на нитроцеллюлозный мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Мембраны высушивали в течение нескольких часов и затем хранили при +4*С.
В качестве отрицательного контроля использовали образец снега, к которому сразу перед внесения метки добавляли 50% ТХУ. Каждое измерение делалось в трех повторностях.
Мембраны помещали в сцинцилляционный флакон, содержащий 10 мл толуольного сцинциллятора (4 г. 2,5-дифенилоксазола, 0,1 г. 1,4-ди-2(5-фенилоксазолин)бензола, 1 л. толуола), выдерживали 30 мин. при +4*С и помещали в сцинцилляционный счетчик.
Расчет интенсивности включения проводился по формуле:
[methyl-3H-thymidine] пмоль/л*ч = k*(DPM/2200)*(1000/V)*(1/SA)*(60/T), где:
* - знак умножения, PM - количество включений в минуту (показания прибора), V - объем образца, SA - молярная активность, T - время инкубации, k - конвертирующий коэффициент, для образцов снега k = 2Ч1018 кл/моль.
Стандартную ошибку измерений рассчитывали по формуле (2) ,
где St - стандартное отклонение, М - среднее значение показателя, Xi - среднее арифметическое показателя, N - количество измерений.
