Приготовление химически компетентных клеток E. coli (кальциевый метод)
Для приготовления химически компетентных клеток использовался кальциевый метод [ 131 ]. В 100 мл теплого SOB инокулировали 500 мкл (1:200) ночной культуры. Клетки помещали на качалку и инкубировали при 37*С до достижения оптической плотности 0,3-0,4. После этого клетки резко охлаждали на водяной бане со льдом и далее все операции проводили на льду. Охлажденную культуру переносили в заранее охлажденные центрифужные пробирки и центрифугировали в течение 10 минут при 4*С, 3000 об./мин. Супернатант декантировали, осадок ресуспендировали в 45 мл холодного 0.1 М CaCl2 и инкубировали в течение 40 мин. Затем центрифугировали еще раз при тех же условиях. Осадки аккуратно ресуспендировали в 2 мл 0.1 М CaCl2 и затем добавляли стерильный 50%-ый раствор глицерина до конечной концентрации около 20-25%. Далее клетки разделяли на аликвоты по 200 мкл и переносили на -70*С.
