Разнообразие микроорганизмов: ПЦР
Реакционная смесь объемом 20 мкл состояла из буферного раствора (20 мМ Трис-HCl, рН 8.8, 10 мМ КСl, 10 мМ (NH4)2SO4, 2мМ MgSO4, 1% Triton X-100), дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (0,25 мМ), прямого и обратного праймеров (пo 0,5 мкМ), ДНК-матрицы (10 нг), Taq-ДНК-полимеразы (2,5 единицы активности). В качестве матрицы использовали плазмидную или геномную ДНК, либо колонии клеток, которые скалывали одноразовым наконечником автоматической пипетки и помещали в пробирку с реакционной смесью для ПЦР.
Программа ПЦР включала 25-30 циклов, состоящих из 3-х этапов:
1) плавление ДНК (95*С, 30 с.)
2) отжиг праймеров (50-65*С - Табл. 2 , 30 с.)
3) амплификация ДНК фрагментов (72*С, время определялось сообразно длине фрагмента). Время амплификации в последнем цикле увеличивали до 5 - 10 мин. Полученные ПЦР-продукты хранили при -20*С.
Для определения таксономической принадлежности изолятов бактерий и клонирования случайных фрагментов генов 16S рРНК использовали праймеры 27F-1492R [ 127 ], для создания библиотек фрагментов V3-V4 генов 16S рРНК для высокопроизводительного секвенирования использовали праймеры 341F-805R [ 128 ], для амплификации фрагментов генов 16S рРНК цианобактерий использовали праймеры CYA106F/CYA359F-CYA781R(a)/CYA781R(b) [129], для амплификации фрагментов генов 16S рРНК архей использовали праймеры 21F-958R [ 130 ], для амплификации вставки в плазмиде pGEM-T использовали праймеры М13F-M13R (pGEM-T easy vector kit, Promega), для амплификации фрагментов, содержащих последовательности спейсеров из CRISPR кассет Flavobacterium psychrophilum , использовали праймеры Flavo_F и Flavo_R.
