Комплекс I (NADH-убихинон-редуктаза) более простого строения
Для дрожжей S. cerevisiae , S. carlsbergensis характерен NADH-убихинон- редуктазный комплекс более простого строения: он не содержит характерных ЖСЦ центров и компонента, чувствительного к действию ротенона , и это коррелирует с отсутствием I пункта энергетического сопряжения (величина АДФ/О при окислении NAD-зависимых субстратов не превышают 2) [ Котельникова ea 1973 ]. Комплекс более простого строения, не содержащих ЖСЦ N2 и компонента, чувствительного к действию ретионона, характерен и для дрожжей С. utilis , выращенных на этаноле и глицерине и собранных в экспоненциальную фазу роста [ Бурбаев ea 1987 , Степанов ea 1989 , Cobley ea 1975 , Gray ea 1975 , Grossman ea 1974 ], либо выращенных на среде, дефицитной по железу (сере) [ Clegg ea 1971 , Garland ea 1970 , Light ea 1968 ]. Переход в стационарную фазу роста, или добавление к среде культивирования железа (или серы ) или длительная аэрация "дефицитных" по железу (сере) клеток способствовала появлению I пункта энергетического сопряжения , чувствительности к ротенону и ЖСЦ Nlb+N2 . Методом низкотемпературной ЭПР-спектроскопии нам удалось впервые детально проследить этапы образования NADH-дегидрогеназного комплекса у С. utilis в ходе периодического культивирования популяции (см. рис. 19 ) [ Бурбаев ea 1987 , Степанов ea 1989 ].
Удалось показать, что на самых ранних стадиях роста (5 ч) окисление NAD-зависимых субстратов было нечувствительно к действию ротенона, окисление NAD-зависимых субстратов и а-глицерофосфата происходило с одинаковой эффективностью фосфорилирования (АДФ/О - 2,0). В спектре ЭПР сигнала в области g= 1,92- 1,96 наблюдался сигнал, который мог быть отнесен к сигналам ЖСЦ S-1 и ЖСЦ N-lb (g=l,934) и не выявлялся сигнал, характерный для центра N-2. На стадии, соответствующей 6 ч роста, восстановления центра N-2 по-прежнему не происходило с физиологическими субстратами, но с дитионитом в присутствии метилвиологена наблюдался перегиб при g= 1,934, свидетельствующий о появлении сигнала N-2 . К 7 ч роста сигнал центра N-2 малой интенсивности появлялся при восстановлении митохондрий системой "пируватом + малат", а при восстановлении дитионитом интенсивность сигнала значительно возрастала. Дыхание митохондрий в этот период оставалось нечувствительным к действию ротенона (см. рис. 19 ). По мере роста интенсивности сигнала центра N-2 постепенно достигая максимума к 10 ч роста. Чувствительность дыхания к ротенону также постепенно увеличивалась, достигая максимума в стационарную фазу роста. Окисление "пирувата + малат" сопровождалось фосфорилированием с эффективностью, близкой к теоретической (АДФ/О=3,0). Полученные данные хорошо согласуются с недавними наблюдениями Фридриха с соавт. [ Friedrich ea 1989 ] структурных изменений комплекса I N. crassa при выращивании клеток в присутствии ингибитора митохондриального белкового синтеза - хлорамфеникола . В этих условиях вместо 620-700 кДа комплекса происходил синтез NADH- убихинонредуктазы существенно меньшего размера (авторы назвали фермент, состоящий из 13 синтезируемых на циторибосомах полипептидов с общей молекулярной массой 350 кДа - " NADH-убихинонредуктаза маленький " фермент). Методом иммуноблотинга было показано, что часть субъединиц маленького NADH- убихинонредуктазы была гомологична субъединицам "нативного" комплекса, одна из них - идентична. Оба фермента имели одинаковое сродство к NADH, 350 кДа комплекс сохранял большую часть Fe-S кластеров, но терял компонент, ответственный за чувствительность к действию ротенона, и имел меньшее сродство к убихинону. Замечательно, что по своим свойствам он очень напоминал NADH-убихинонредуктазу экспоненциально растущих клеток С. utilis (см. выше). Высокая комплементарная природа "маленького" фермента и сходство его с ферментом из С. utilis позволили авторам высказать предположение о том, что он, возможно, является примитивной формой комплекса I. Его превращение в "нативный" комплекс может осуществляться либо путем последовательного присоединения субъединиц, либо путем комбинации с другим субкомплексом. Анализ сборки комплекса I (при выращивании клеток N. crassa на среде с S35-метионином ) показал [ Tuschen ea 1990 ], что при этом образуется промежуточная (350 кДа) форма фермента, содержащая все кодируемые митохондриальным геномом субъединицы и те синтезируемые на циторибосомах субъединицы, которые отсутствовали в "маленькой" NADH-убихинонредуктазе. Вместе они давали субъединичный состав нативного комплекса L. На основании этих данных была предложена модель сборки комплекса I N. crassa из этих двух собираемых независимым способом частей комплекса (см. рис. 20 ). Приобретение "внутреннего" убихинона означает, по мнению авторов, появление циклического механизма - окисления-восстановления убихинона и возможность транслокации Н+, увеличения Н+/е стехиометрии. Хотя эта интересная гипотеза, как признаются сами авторы, пока еще лишена экспериментального обоснования, она несомненно заинтересует биоэнергетиков, занимающихся механизмом переноса электронов в I комплексе дыхательной цепи.
