МИТОХОНДРИИ ДРОЖЖЕЙ: КРИТЕРИИ ИНТАКТНОСТИ
Успех выбранного метода (процедуры) выделения митохондрий может быть оценен с помощью ряда биохимических тестов митохондриальных функций [ Lloyd ea 1974 ]. Многолетний опыт работы подсказывает, что физиологические интактные дрожжевые митохондрии:
1) должны иметь хорошую сохранность внешней и внутренней митохондриальных мембран (см. например, рис. 4 );
2) не должны иметь сколько-нибудь значительного эндогенного (в отсутствие добавленных субстратов) дыхания;
3) должны обладать низкой (менее 2-3 нмоль/мин/мг белка) сукцинат-цитохром с-редуктазной активностью, что свидетельствует об интактности внешней мембраны;
4) внутренняя митохондриальная мембрана должна быть непроницаема для феррицианида и NADH [ Jagow ea 1970 ];
5) окисление всех добавленных субстратов должно осуществляться без добавления кофакторов типа NAD(P)H или цитохрома с, что однозначно свидетельствует о сохранении этих кофакторов в процессе выделения органелл. Полезно также и прямое определение содержания эндогенных никотинамидадениновых нуклеотидов и цитохрома с;
6) митохондрии должны обладать эффективностью окислительного фосфорилирования, близкой к теоретической (т. е, величина ADP/0 - показателя эффективности процесса окислительного фосфорилиро- вания при окислении сукцината, а-глицерофосфата и экзогенного NADH
7) митохондрии должны иметь высокие величины дыхательного контроля , определяющие уровень сопряжения дыхания и фосфорилирования - на рис. 5 величины дыхательного контроля при окислении NAD-зависимых субстратов составляют 4-5;
8) должны сохранять регуляцию метаболического состояния. На рис. 5 видны многократные характерные переходы из 3-го в 4-ое метаболическое состояние . Добавление ADP к митохондриям в 4-ом метаболическом состоянии должно индуцировать немедленное ускорение дыхания (переход в состояние 3), а фосфорилирование ADP - сопровождаться возвратом в состояние 4. Такие многократные циклы должны наблюдаться вплоть до полного исчерпания O2 в инкубационной среде;
9) для интактных митохондрий характерна генерация трансмембранного потенциала (Д-f) высоких значений. На рис. 6 приведены кривые, показывающие изменения распределения проникающего катиона - тетрафенилфосфония (ТРР+) , между внешней средой и митохондриальной мембраной в ответ на энергизацию митохондрий добавлением различных субстратов окисления, в том числе ферроцианида ( 3-ий пункт сопряжения ). Видно обратимое уменьшение мембранного потенциала при добавлении ADP (явление, аналогичное дыхательному контролю) и необратимое снятие ингибиторами переноса электронов. Величины потенциалов в расчете на митохондриальную воду (0,8 мкл/мг белка) составляли 200-230 мВ - один из самых высоких, приводимых в литературе;
10) митохондрии в растворах маннита и трис-солей должны вести себя как идеальные осмометры ( рис. 7 ), для них должны быть характерны отсутствие пассивной проницаемости для ионов Cl+ , триса* и низкая пассивная проницаемость для ионов К+ и Na+ ( рис. 8 ), т. е. изотоничные растворы ацетата калия и натрия (ацетат - проникающий анион) не должны вызывать быстрого набухания митохондрий (сравни набухание в CH3COONH4 , NH4H2PO4 ) Следует заметить, что, по нашему наблюдению, это наиболее тонкий биохимический тест на интактность внутренней митохондриальной мембраны. Препараты, имевшие теоретическую эффективность фосфорилирования, прочное сопряжение, генерировавшие трансмембранный потенциал высоких значений, обнаруживали вариабельное поведение в отношении пассивного набухания в растворах ацетата натрия и калия. Более того, хранение клеток дрожжей при 0 -4*С в течение 1-2 суток, не приводившее к изменению параметров, характеризующих работу аппарата сопряжения (величины ADP/O , дыхательного контроля , дельта пси ), индуцировало пассивную проницаемость митохондрий для Na+ и К+.
11) Помимо перечисленных выше цитологических и биохимических тестов, уже использовавшихся в литературе для оценки степени интактности выделяемых митохондриальных препаратов, нами предложен дополнительный тест. Было замечено, что только в прочносопряженных митохондриях добавление KCN и салицилгидроксамата ( ингибитора альтернативного окислительного пути ) приводило к 99-100% ингибированию дыхания митохондрий со всеми исследованными субстратами. "Старение" митохондрий, повреждение структуры приводило к появлению значительной доли дыхания, резистентного к действию ингибиторов.
