Оксидаза альтернативная: история изучения
История изучения природы альтернативной оксидазы полна драматизма. Невозможность обнаружения в составе альтернативного пути ни одного из известных цитохромов [ Соколов ea 1977 , Haddock ea 1971 , Henry ea 1977a ], а также ингибирование альтернативного пути производными гидроксамовых кислот , агентами, хелатирующими катионы с переменной валентностью, главным образом Fe , позволили предположить [ Henry ea 1975 ], что наиболее вероятным кандидатом на роль терминальной цианидрезистентной оксидазы является негеминовое железо . Были получены и некоторые другие подтверждения правильности такого предположения;
1) предотвращение развития альтернативного пути при выращивании дрожжей в присутствии гидроксамовых кислот [ Henry ea 1977 ];
2) обращение ингибирующего действия гидроксамовых кислот на цианидрезистеитное дыхание целых клеток и митохондрий катионами металлов Fe(III) , Сu(II) , Al(IlI) , Сu(II) ; прямая зависимость между скоростью восстановления дыхания и концентрацией добавленного Fe(III) [ Henry ea 1977a ];
3) ускорение в присутствии Fe(III) биогенеза альтернативного пути и увеличение его вклада в общее измеряемое дыхание [ Henry ea 1977 ];
4) индукция альтернативного пути в клетках Torula utilis , выращенных на дефицитной по сере среде, инкубацией с 250 мкМ сульфатом [ Haddock ea 1971 ];
5) ингибирование цианидрезистентного пути у Rh. mucilaginosa карбоксином , хелатором Fe(II), ингибитором сукцинатдегидрогеназы [ Mackler ea 1980 ]. При этом эффективность действия карбоксина была обратно пропорциональна концентрации 02. Постулировалось, что ингибирующий эффект обусловлен конкуренцией с О2 в одном из координационных центров Fe-S-кластеров сукцинатдегидрогеназы; действие гидроксамовых кислот , вероятно, обусловлено связыванием Fe(II) того же Fe-S-белка. Нетрудно заметить, что некоторые из перечисленных доказательств участия Fe-S-белка(ов) в альтернативном пути являются косвенными. Более того, было обращено внимание на очевидное несоответствие между способностью гидроксамовых кислот обратимо инактивировать альтернативный путь и связывать железо Fe-S-белков только после денатурации последних [ Воnner ea 1978 , Rich ea 1978 ]. Выяснилось далее, что гидроксамовые кислоты ингибируют не только цианидрезистентную оксидазу [ Schonbaum ea 1971 ], но и другие ферменты [ Opperdoes ea 1976 , Parrish ea 1978 , Rich ea 1978 ]. Было высказано предположение, что ингибирующий эффект гидроксамовых кислот обусловлен не хелатированием металла, а конкуренцией с восстановленными гидрохинонами за их точку связывания. Было замечено также, что лишь в митохондриях (растений) с высокой активностью альтернативного пути наблюдалась сверхтонкая структура расщепленного ЭПР-сигнала с g больше 2,0, приписываемая спин- спиновому взаимодействию железосерного центра S-3 сукцинатдегидрогеназы с семихинонами [ Воnner ea 1978 , Moore ea 1978 , Rich ea 1978 , Rich ea 1977 ]. На этом основании авторы, используя протон-движущий цикл Митчела [ Mitchell ea 1975 , Mitchell ea 1976 ], постулировали, что альтернативная оксидаза включает обращение стадии восстановления сукцинатдегидрогеназой QH- в QH2-. Эта гипотеза подкупала своей простотой, отсутствием необходимости постулировать участие компонентов, не выявляемых ни методами ЭПР, ни спектральными методами, однако в рамках этой гипотезы оставалось необъясненным сохранение цианидрезистентного пути при полной экстракции сукцинатдегидрогеназы.
В 1978 г. одновременно в двух лабораториях было сообщено о выделении (из растительных митохондрий) хинолоксидазы , устойчивой к действию цианида и чувствительной к производным гидроксамовых кислот [ Hug ea 1978 , Rich ea 1978 ]. Частично очищенный препарат фермента оказался медьсодержащим флавопротеидом! Однако Дж. Вандерпейдену и др. [ Steffens ea 1987 ] и В. Акименко [см. Акименко ea 1981 ] не удалось воспроизвести эти данные. Более того, было обращено внимание на некорректность использования дурохинола в хинолоксидантном тесте, поскольку дурохинол может автоокисляться в присутствии многих белковых факторов (даже бычьего сывороточного альбумина), содержащих следы металлов; при этом автоокисление ингибировалось бензгидроксамовой кислотой и стимулировалось добавлением AMP, мимикрируя тем самым свойства самой оксидазы! Длительные неудачи в выделении альтернативной оксидазы побудили даже некоторых авторов поставить под сомнение существование альтернативной оксидазы как индивидуального белка и высказать предположение о том, что активность цианидрезистентного альтернативного пути может целиком объясняться радикальными реакциями с участием компонентов дыхательной цепи [ Rustin ea 1984 ] (см. рис. 30 ). Известно, что при переносе электронов вдоль дыхательной цепи при восстановлении флавопротеинов и убихинона образуются супероксид-ионрадикалы [ Boveris ea 1976 , Boveris ea 1978 , Cadenas ea 1977 , Turrens ea 1980 ], взаимодействующие в норме с митохондриальной супероксиддисмутазой (СОД) с образованием H2O2, которая расщепляется каталазой до Н2О. Однако до 20% супероксидион-радикалов ускользает из- под действия СОД и взаимодействует с жирными кислотами , вызывая перекисное окисление липидов .
В рамках постулируемой гипотезы авторы сумели объяснить:
1) ингибирующий эффект разных по своей химической природе соединений (производных гидроксамовых кислот , цитокининов , теноилтрифторацетона , пропилгаллата и др.), являющихся, как выяснилось, ингибиторами перекисного окисления липидов ;
2) приуроченность цианидрезистентного дыхания в митохондриях растений к окислению малата , но не NADH;
3) связь альтернативного пути с обменом этилена - индуктора перекисного окисления и, в свою очередь, продукта гидроперекисной реакции. По сути авторы попытались дать интегративную картину и описать многие природные и экспериментальные условия, способствующие индукции цианидрезистентного дыхания у растений. Работа производит очень сильное впечатление и, хотя авторы игнорировали многочисленные доказательства зависимости индукции цианидрезистентного дыхания от синтеза белка de novo, уже нельзя не считаться с возможностью включения радикальных реакций в альтернативное цианидрезистентное дыхание.
На фоне зашедших в тупик работ по выделению альтернативной оксидазы одно время обнадеживающими казались исследования Бурбаева с сотр. [ Бурбаев ea 1987 , Вахнина ea 1982 ] по выявлению методом ЭПР новых железосерных центров в области g=2,02-2,03, условно названных авторами ЖСЦ-1 и ЖСЦ-2. Для каждого типа сигнала были подобраны оптимальные условия регистрации, позволившие наблюдать их без наложения других сигналов, определены их характеристики. На основании анализа влияния субстратов на характеристики ЖСЦ-1 и ЖСЦ-2 был сделан предварительный вывод о том, что оба центра, вероятнее всего, являются компонентами альтернативной оксидазы, поскольку в присутствии салицилгидроксамата имело место резкое возрастание интенсивности их сигналов [ Бурбаев ea 1987 , Вахнина ea 1982 ], происходили обратимые перестройки четырехъядерной структуры в трехъядерную.
Прогресс в выделении активной альтернативной оксидазы давался с большим трудом. И вот, в 1986 г. [ Bonner ea 1986 ], было сообщено о выделении из митохондрий ароидных препарата менадионредуктазы , свободного от примеси липоксигеназы и содержащего многие белки, среди которых, однако, доминировал 34 кДа белок. Затем в 1986-1987 гг. [ Elthon ea 1986 , Elthon ea 1987 ] путем сочетания классических методов очистки с иммунохимическими методами удалось получить из чрезвычайно активных термогенных тканей Sauromatum guttatum очищенный в 168 раз препарат альтернативной оксидазы, содержанией 36 и 35,5 кДа белков. Эта работа имела очень интересное и важное продолжение. В 1989 г. [ Elthon ea 1989 ] сообщили о связи белков с мол. массой 37 и 36,5 кДа с альтернативной оксидазой у ряда высших растений, водорослей и N. crassa. Интересно, что независимым методом было найдено, что рост Hansenula anomala в присутствии антимицина А индуцирует появление белка с мол. массой 36 кДа [ Minagawa ea 1990 , Yoshimoto ea 1989 ]. Эти данные дают основания утверждать, что наконец-то столь давно искомая альтернативная оксидаза найдена! И что она, по-видимому, довольно консервативна [см. Obenland ea 1990 , Stewart ea 1990 ]. Правда, пока можно говорить лишь об идентификации альтернативной оксидазы, ее природа, структура остаются по-прежнему неизвестными. Однако, учитывая яркие успехи последних лет в области молекулярной биологии дрожжей и грибов, можно надеяться, что расшифровка структуры альтернативной оксидазы - вопрос ближайшего времени. Тем более, что работой [ Elthon ea 1989 ] удалось соединить две до сих пор независимые линии исследования - биохимическую и генетическую. В работе [ Bertrand ea 1983 ] на основании анализа мутантов N. crassa , не способных синтезировать альтернативную оксидазу при росте клеток на среде с ингибиторами белкового синтеза, были отобраны две комплементационные группы - aod-1 и aod-2 и высказано предположение, что aod-1 является структурным геном альтернативной оксидазы, а продукт гена aod-2 необходим для индукции альтернативной оксидазы, возможно, регулируя экспрессию aod-1 гена на транскрипционном или посттранскрипционном уровне.
