Синтез пирофосфата (PPi), сопряженный с работой дыхательной цепи
Первые указания на связь биосинтеза неорганического пирофосфата (PPн) с работой цепи переноса электронов были получены в работах М. Балтчевского с соавт. [см., например, Baltscheffsky ea 1967 , Baltscheffsky ea 1966 ] при изучении фотофосфорилирования в хроматофорах Rhodospirillum rubrum. Позднее энергозависимый синтез РРн был обнаружен в митохондриях печени крысы и сердца быка [ Мансурова ea 1973 , Шахов ea 1974 ]. В совместных исследованиях с С. Э. Мансуровой мы попытались выяснить, насколько универсальна эта реакция, может ли она осуществляться в митоходнриях дрожжей - низших эукариот и имеются ли различия в протекании реакции в митохондриях дрожжей, относящихся к различным таксономическим группам и имеющим выраженную специфику энергетического обмена [ Мансурова ea 1975 , Мансурова ea 1977 ]. С помощью аналитического метода было показано, что митохондрии End. magnusii при инкубации их при комнатной температуре в течение 10 мин в среде, содержащей неорганический фосфат, ионы магния и сукцинат (в качестве субстрата окисления) в 10 раз увеличивали количество РРн, что указывало на их способность осуществлять интенсивный синтез этого макроэргического соединения ( рис. 39 ). С помощью изотопной техники (Р32) была не только подтверждена способность дрожжевых митохондрий синтезировать РРн, но и показано ( рис. 40 ), что биосинтез этого соединения в значительной мере зависел от присутствия в инкубационной среде акцептора фосфата - ADP : при добавлении ADP имел место, в основном, синтез АТР, в отсутствии ADP - интенсивный синтез РРн, превосходящий синтез АТР. Ингибиторы переноса электронов антимицин А (10 мкг/мг белка) и KCN (1,5-10~3 М) и разобщитель окислительного фосфорилирования ДНФ (5-10~4 М), деэнергизирующие мембрану, ингибировали синтез как АТФ, так и РРн-. Аналогичные данные были получены для митохондрий S. cerevisiae и S. italicus; они свидетельствовали о связи биосинтеза РРн в дрожжевых митохондриях с работой дыхательной цепи. Были представлены доказательства, что эта связь не опосредована потреблением АТР, образовавшимся в результате функционирования дыхательной цепи: олигомицин (10 мкг/мг митохондриалыюго белка), ингибитор переноса энергии, стимулировал синтез РРн при полном подавлении образования АТР.
Следовательно, в митохондриях низших эукариотов (Е. magnusii, S. cerevisiae и S. italicus) РРн мог синтезироваться в качестве первичного продукта окислительного фосфорилирования независимо от АТР (за счет, вероятно, мембранного потенциала). В работах по изучению биосинтеза РРн хроматофорами Rh. rubrum в процессе фотофосфорилирования [ Baltscheffsky ea 1966 ] и животными митохондриями в процессе окислительного фосфорилирования [ Мансурова ea 1977 ] постулировалось возможное участие в этом процессе неорганической пирофосфатазы . В митохондриях Е. magnusii действительно была обнаружена активная неорганическая пирофосфатаза [ Кулаев ea 1973 ]. Для выяснения роли этого фермента в сопряженном с дыханием образовании РРн митохондриями Е, magnusii был применен ингибитор фосфорного обмена - фтористый натрий . Найдено, что NaF в концентрации 10~3 М (на 90% ингибирующей РРн-азную активность без существенного влияния на АТР-азную активность) почти полностью блокировал включение Р32-ортофосфата в РРн> практически не затрагивая синтез АТР. Таким образом, митохондрии дрожжей, также как и митохондрии высших организмов, способны осуществлять зависимый от мембранного потенциала биосинтез РРН с неорганической пирофосфатазой в качестве кофактора сопряжения.
Использование энергии гидролиза РРн для синтеза АТР
