Метод ПЦР-опосредованного сайт-направленного мутагенеза
Если естественных рестрикционных сайтов в месте мутации найти не удается, то такие сайты могут быть созданы искусственно. В частности, разработана методика создания с помощью ПЦР новых сайтов рестрикции в мутантных аллелях, но не в аллелях дикого типа - метод ПЦР-опосредованного сайт-направленного мутагенеза [ Eiken H.G. et al., 1991 ; Ngo I.C.L. et al., 1991 ]. Для этого амплифицируемый участок ДНК выбирают таким образом, чтобы 3'- конец одного из праймеров непосредственно примыкал к мутантному сайту ( рис. 4.8 ). Именно этот праймер неполностью комплементарен матричной ДНК. В нем изменяют один из нуклеотидов с 3'-конца так, чтобы в сочетании с нуклеотидом мутантного, но не нормального сайта в этом месте образовывался сайт рестрикции для какой-нибудь из эндонуклеаз. Тогда после рестрикции и электрофореза продуктов амплификации геномной ДНК у индивидуумов, не содержащих данную мутацию, на электрофореграмме будет присутствовать один нерестрицированный фрагмент, у гетерозигот появится два дополнительных фрагмента, соответствующих по длине рестрицированным сегментам ДНК, и у гомозигот по мутации будут присутствовать только эти два фрагмента.
