Маркерные генотипы
Возможность идентификации мутантных генов родителей на основе анализа маркерных генотипов определяет информативность семьи по отношению к данному маркеру. На рис. 7.1 представлены возможные маркерные генотипы в полностью и частично информативных, а также в неинформативных семьях при определении их путем блот- гибридизации с ДНК-зондом. Аналогичные схемы могут быть составлены и в тех случаях, когда маркерные генотипы определяются путем анализа содержащих полиморфные локусы амплифицированных фрагментов ДНК. В информативных семьях маркерный генотип больного ребенка отличается от маркерных генотипов обоих родителей и здорового сибса, поэтому можно проследить наследование мутантных генов при каждой беременности. В этом случае сходства маркерных генотипов пробанда и плода достаточно для неблагоприятного прогноза, а носители мутации будут иметь родительский генотип.
В частично информативных семьях идентифицируется только один из мутантных генов, так как маркерный генотип больного ребенка совпадает с генотипом одного или даже обоих родителей. В этом случае при сходстве маркерных генотипов плода и пробанда вероятность болезни будущего ребенка составляет 50%. Все дети с другим маркерным генотипом будут здоровы, но половина из них будут нести один из мутантных аллелей. Неинформативный маркер не пригоден для идентификации мутантных генов, а следовательно, и для проведения молекулярной диагностики в данной семье. При отсутствии полной информативности необходимо исследовать другие сцепленные с геном полиморфные локусы и выбрать в качестве маркеров те из них, которые у родителей пробанда находятся в гетерозиготном состоянии. В частично информативных семьях можно проводить пренатальную диагностику с такой же степенью достоверности, как и в полностью информативных семьях, при одновременном использовании двух полиморфных локусов, каждый из которых маркирует разные мутантные гены обоих родителей.
Информативными оказываются также те семьи, в которых один из мутантных аллелей может быть идентифицирован прямым анализом соответствующего участка гена, а наличие другого мутантного аллеля доказывается с помощью маркерного локуса. Для многих моногенных наследственных заболеваний количества идентифицированных высокополиморфных локусов, тесно сцепленных с контролирующим геном, достаточно для того, чтобы более 90% семей высокого риска оказались полностью информативными, а значит, пригодными для проведения в них пренатальной диагностики с использованием молекулярных методов тестирования состояния плода.
Таким образом, при отсутствии возможности прямой идентификации соответствующих мутантных аллелей анализ информативности семьи следует начинать с наиболее полиморфных маркерных локусов, так как при этом больше вероятность того, что родители больного ребенка окажутся гетерозиготами по выбранному маркеру. При последующем выборе маркеров важно также учитывать наличие между ними неравновесности по сцеплению, так как чаще всего информативность семей в отношении маркеров, находящихся в сильном неравновесии по сцеплению, будет одинакова. Действительно, неслучайный характер цис- и транс-расположения аллелей в неравновесных по сцеплению локусах обусловливает повышенную вероятность таких событий, при которых гомозиготы по одному из маркеров оказываются гомозиготными и по другому. То же самое справедливо и в отношении гетерозигот. Поэтому при анализе информативности семьи, в первую очередь, следует выбирать маркерные локусы, находящиеся между собой в равновесии по сцеплению.
Следует также учитывать, что определенные аллели полиморфных сайтов, расположенных близко к мутации, возникшей однократно много лет назад и распространившейся в популяции, будут оставаться в очень тесном неравновесии по сцеплению. Примером может служить неравновесность между delF508 (ориентировочный возраст возникновения 30-50 тысяч лет) и 6-членным тетрамерным повтором TAGG в интроне 6 гена муковисцидоза [ Агбангла К. и др, 1994 ; Chebab F.F. et al., 1993 ]. Поэтому в семьях высокого риска с большой долей вероятности, конкретное значение которой определяется детерминантом неравновесности по сцеплению, гомозиготы по этому маркерному аллелю окажутся также гомозиготами и по мутации, т. е. будут больны. Конечно, пренатальный диагноз не может быть основан только на этой информации, однако ее следует учитывать при выработке комплексного заключения относительно здоровья будущего ребенка.
Во всех случаях при использовании косвенных методов молекулярной диагностики необходимо также помнить, что маркерный генотип плода определяет наличие мутантных генов с точностью до вероятности кроссинговера между мутантным аллелем и маркерным локусом. Поэтому чем ближе расположен маркер по отношению к мутантному аллелю, тем меньше вероятность ошибки при проведении пренатальной диагностики. Для того, чтобы полностью избежать или, по крайней мере, резко снизить вероятность такой ошибки, желательно использовать внутригенные маркеры или проводить одновременное тестирование ДНК плода с помощью двух маркерных локусов, фланкирующих мутантный аллель. Последний подход особенно оправдан при работе с очень протяженными генами (например, геном дистрофина длиной около 2,2 млн п.о.), где вероятность внутригенного кроссинговера по некоторым данным может достигать 2 - 2,5%.
