Гомологичная рекомбинация у E. Coli
Показано, что процесс гомологичной рекомбинации у бактерии Escherichia coli обеспечивают четыре белка: RecA, RecB, RecC и RecD. Белок RecA способствует спариванию однонитевой молекулы ДНК с гомологичной ей двунитевой молекулой. С однонитевой ДНК RecA белок связывается гораздо эффективнее, чем с двунитевой (см. обзор: Cox, Lehman, 1987 ; Сталь, 1987; Dressler, Potter, 1982 ). Белки RecB, RecC и RecD образуют единый ферментативный комплекс, названный RecBCD-нуклеаза ( Amudsen et al., 1986 ). Этот комплекс способен расплетать двойную цепь ДНК. В том случае, если в последовательности, с которой взаимодействует RecBCD-нуклеаза встречается определенным образом ориентированная последовательность длиной 8 нуклеотидов, называемая Chi- сайтом , она разрезает одну из двух нитей ДНК. Наличие таких разрезанных цепей ДНК значительно увеличивает частоту гомологичных рекомбинаций в районе Chi-сайта. Chi-Сайт обнаружен при изучении мутантов в фаге l. Оказалось, что он имеет последовательность GYTRGYRG и обладает способностью усиливать гомологичную рекомбинации вблизи себя на несколько порядков ( Ponticelli et al., 1985 ).
У E. coli в рекомбинацию, проводимую белком RecA, вовлечено более 20 белков [ Kowalczykowski S.C., ea, 1994 , Clark A.J., Sandler S.J., 1994 ]. Рекомбинация инициируется переходом белка RecA в активную форму RecA*, представляющую собой тройной комплекс RecA::АТР::онДНК, который образуется при полимеризации протомеров RecA на онДНК в присутствии АТР. Значит, как и в случае SOS-ответа, онДНК выступает в качестве "затравки" процесса. Как мы отмечали выше, в норме при гомологичной рекомбинации SOS-ответ выражен слабо.
Каким образом RecA* делает выбор между запуском SOS-ответа и инициированием гомологичной рекомбинации? Оказывается, все зависит от ситуации в клетке: быстрое сбрасывание белка SSB с онДНК (этот белок распрямляет онДНК, ликвидируя в ней вторичные структуры) с помощью бинарного комплекса RecA::АТР, т.е. быстрое формирование тройного комплекса приведет к SOS-ответу, который индуцирует также и синтез ряда рекомбинационных ферментов; медленное формирование тройного комплекса завершается только гомологичной рекомбинацией со слабой SOS-индукцией. Как видно, скорость сборки комплекса должна зависеть от рекомбиногенной активности самого белка RecA. Например, мутантные белки, такие как RecА441 и RecA730, могут индуцировать SOS-функции конститутивно [ Lavery P.E., Kowalczykovski S.C., 1992 ] и, как следствие, вызвать гиперрекомбинацию (высокие частоты обменов на единицу длины ДНК), тогда как белок RecA из Pseudomonas aeruginosa обеспечивает гиперрекомбинацию без заметной индукции SOS-функций [ Namsaraev E.A., 1997 ].
Филамент RecA::АТР::онДНК имеет спиральную структуру и способен втягивать внутрь своей спирали молекулы днДНК партнера с образованием трехнитевой структуры, в которой и разыгрывается основной акт рекомбинации - переключение комплементарного спаривания, что и приводит к "переносу" одной из нитей вошедшей ДНК на онДНК, находящуюся внутри филамента.
Как видно, небольшой по размеру белок RecA (у бактерий его мол. масса составляет (40 кДа) - полифункционален: он взаимодействует с АТР, образует филамент на онДНК, взаимодействует с днДНК, осуществляет гомологичный синапс молекул ДНК и перенос нити. В ходе взаимодействия с АТР и онДНК белок претерпевает конформационные изменения, а в реакции переноса нити он использует свою ДНК-зависимую АТР-азную активность, которая особенно необходима при взаимодействии областей ДНК с несовершенной гомологией. Моделью реакции переноса нити ДНК in vitro является перенос нити с линейной молекулы днДНК фага М13 или (Х174 на кольцевую онДНК того же фага [ Cox M.M., Lehman I.R., 1987 ].
Этой и подобным экспериментальным системам мы обязаны современным знаниям о молекулярном механизме гомологичной рекомбинации.
