Бактериофаг M13
Фаги E.coli, осуществляющие репликацию через ssДНК-посредни- ка, такие как M13 и fX174, реплицируются по механизму катящегося кольца[ Baas, P.D., 1985 , Baas, P.D. and H.S.Jansz. 1988 ].
Они кодируют белок, который инициирует репликацию путем надрезания специфического сайта (nick site) внутри начала репликации фага. Получающийся 3'-конец используется для синтеза праймерной ДНК, постепенно замещая надрезанную нить. Белок также терминирует репликацию фага, рассекая замещенную нить в конце цикла репликации и заклеивая ее, в результате чего создается ковалентно-замкнутая круговая молекула ssДНК. Эта молекула переводится в двуцепочечную форму ферментами хозяина или инкапсидируется белками фага, давая начало фаговой частице.
Вовлечение гена II репликационного белка фага M13 [ Meyer, T.F. et al. 1979 ] в незаконную рекомбинацию [ Michel, B. and S.D. Ehrlich 1986 ] было показано путем анализа делеций , сгенерированых в гибридных плазмидах , составленых из M13mp2 pBR322 и pC194 (плазмида, изолированая из S.aureus, которая реплицируется в Bacillus subtilis и E.coli) [ Ehrlich, S.D. 1977 , Goze, A. and S.D. Ehrlich 1980 , Iordanescu, S. 1975 ,]. Гибриды были жизнеспособны в B.subtilis, но не в E.coli. Жизнеспособные делеционные мутанты, утерявшие последовательности M13, бы- ли найдены в E.coli. Рестрикционный анализ показан, что делеции заканчивались почти во всех этих мутантах (23/25) в начале репликации M13. В трех из десяти плазмид, проанализированных секвенированием, концы делеций могут быть определены без сомнения, так как не было найдено гомологии между рекомбинирующими последовательностями. Один конец был постоянным и соответствовал 5'-концу, смежному с nick-сайтом, а другой конец варьировал. В остальных семи плазмидах локализация делеционных концов была затруднена наличием 2-6-н.п. гомологии, но внутри рекомбинирующих последовательностей всегда присутствовал 5'-нуклеотид, прилегающий к nick- сайту. Если белок репликации фага был инактивирован, делеции шли в 50-100 раз реже и ни одна не кончалась на этом нуклеотиде.
Вышеописанное может быть объяснено двумя моделями. Белок гена II может инициировать репликацию правильно,но преждевременно терминировать синтез путем расщепления образующейся нити ДНК в последовательности, похожей на сигнал терминации. Получающаяся круговая ss-молекула может быть преобразована хозяйским аппаратом в ds-форму, как и при нормальной репликации. В другом случае, формирование делеции может включаться путем надрезания начала репликации и завершаться другими клеточными функциями. Первая модель предполагает, что концевые последовательности в разных делециях похожи на сигнал терминации, который содержит в себе 10 нуклеотидных пар против и 11-29 н.п. по направлению nick-сайта M13 [ Dotto, G.P. et al. 1983 ], а вторая модель не предполагает подобной схожести.
Были проанализированы несколько сотен делеций, чтобы выбрать модель. Были выявлены три плазмидных района, которые часто рекомбинируют с nick-сайтом; их назвали горячими точками A, B и C. До 40% делеций оканчивались на горячей точке в плазмидах, из которых были удалены остальные две горячие точки. Если менее 10% делеций оканчивались на горячей точке, то она считалась неактивной.
Горячая точка A соответствует последовательности pBR322 с 1610 по 1700 и содержит множество различных концевых точек. Не было обнаружено никакой гомологии с nick-сайтом ни в одной из них. Горячие точки B и C соответствуют последовательностям pC194 с 1388 по 1365 и с 225 по 248 соответственно. Горячая точка B была высоко (20/25 н.п. совпадали) , а горячая точка C была менее (13/25 н.п. совпадало) гомологична с началом репликации M13. В горячих точках B и C наблюдались уникальные рекомбинационные сайты.
Горячие точки A и C были активны только в хозяине, который имел функциональный геликазный ген rep. Эта геликаза требуется для продолжения репликационной вилки, инициированной в реплкаторе ssДНК фагов [ Lane, D.H.E. and D.T. Denhardt 1974 ]. Горячая точка B не зависeла от гена rep, но для ее активности требовался уровень экспрессии дикого типа ДНК-лигазы (она была не активна в клетках lig-7, которые имеют термочувствительную лигазу и были выдержаны в рестриктивной температуре 2 часа при получении плазмидной ДНК путем трансформации). Горячие точки A и C этого не требовали.
Кроме трех "натуральных" горячих точек (A, B и C), путем внедрения в гибридную плазмиду синтетического палиндрома длиной около 30 н.п. были получены три "искусственные" горячие точки, которые не имеют никакой гомологии с началом репликации M13. Эти горячие точки рекомбинируют с nick-сайтом в отсутствие rep-геликазы, не требуют лигазы в количествах дикого типа и содержат большое количество различных делеционных концевых точек. Концевые точки почти всегда локализованы (14/15 случаев) около основания или стороны концевого палиндрома , ближайшего к первичной точке разрыва.
Механизмы формирования делеций в различных горячих точках не совсем понятны. Тем не менее, можно предположить, что по меньшей мере некоторые, а возможно и все горячие точки действуют через остановку движения репликационной вилки . 3'-нуклеотид в остановленой вилке может, таким образом, сделаться доступным для присоединения к 5'-нуклеотиду в nick-сайте, возможно посредством ДНК- лигазы. Предположение основано на следующих расчетах. (i) Известно, что палиндромы работают как сайты пауз в репликации, оста- навливая вилку в позиции, похожей на ту, которая рассматривалась для концевых точек делеции (основание или сторона палиндрома, ближайшего к сайту инициации репликации) [ Kaguni, L.S. and D.A. Clayton 1982 ]. (ii)
Существуют также непалиндромические сайты пауз, которые узнаются специфическими полимеразами. Это может объяснить то, что непалиндромическая горячая точка A активна, только если репликационной вилке M13 разрешено двигаться (в rep , а не в rep-мутантных хозяевах). (iii) Лигаза требовалась для формирования делеции в горячей точке B. Это не было обнаружено в остальных горячих точках, вероятно, потому, что мутация была слабой и требовалось меньше лигазы для этих горячих точек. Напротив, в горячих точках, кроме B, делеции, возможно, были получены при инкубации клеток lig-7 при допустимой температуре, а не при рестриктивной температуре сразу после трансформации. Вероятная роль ДНК лигазы в присоединении несмежных нуклеотидов рассматривается в разделе Ошибки репликации.
Могут ли горячие точки B и C, которые гомологичны с началом репликации M13, действовать как анормальный терминационный сигнал для белка репликации фага, а не как сайты репликационной паузы? Это маловероятно для горячей точки B, для функционирования которой требуется уровень экспрессии дикого типа ДНК-лигазы. Этого бы не требовалось, если бы присоединение было опосредовано репликацион- ным белком. Горячая точка C могла бы быть сайтом для аберрантной терминации белком гена II, так как не требует уровень экспрессии дикого типа ДНК-лигазы.Тем не менее, гомология между этой горячей точкой и началом репликации не простирается на район, важный для терминации репликации фага, что говорит против данной интерпретации.
Были также найдены делеции, оканчивающиеся на 3'-нуклеотиде от nick-сайта фага, а не на 5'-нуклеотиде [ Horiuchi, K. et al. 1978 ]. Было предположено, что подобные делеции были результатом катализируемого лигазой присоединения 3'-нуклеотида, соседнего с nick-сайтом к 5'-нуклеотиду, возникающему в любом месте молекулы [ 192 ].
Результаты, взятые вместе, указывают, что делеции чаще всего только включаются, но не завершаются репликационным белком M13. Другие клеточные функции завершают образование делеций, включенных надрезанием началом репликации M13.
